花 莉， 彭香玉， 范 洋， 解井坤

(陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

石油是一種成分極其復(fù)雜的混合物，并且不同來源的原油的成分具有很大區(qū)別.石油中的烴類一般可分為兩類：飽和烴類(直鏈烷烴、支鏈烷烴、環(huán)烷烴等)和不飽和烴類(烯烴、炔烴、單環(huán)芳烴、多環(huán)芳烴、雜環(huán)芳烴等)[1].微生物降解就是利用石油烴類作為碳源，經(jīng)過一系列氧化、還原、分解、合成等生化作用，將石油污染物礦化轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的無機(jī)物質(zhì)CO2和 H2O的過程.

Kiesele[2]在研究細(xì)菌和霉菌對石油降解能力時,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Acinetobactercalcoaeticus只能降解C22～C30的石油烴并且對石油有乳化作用;而Serratiamarcescens只降解C20～C28的石油烴并且對石油具有較大吸附能力；霉菌Candidatropicalis能降解 C12～C32的石油物質(zhì)，還具有較大的乳化石油的能力.

不同微生物對不同石油烴的成分有不同的降解能力，或者在降解過程中起著不同的作用.Lee等[3]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)己烷能被Rhodococcussp. EC1降解；Chakraborty等[4]發(fā)現(xiàn)在提供硝酸鹽電子受體情況下，DechloromonasRCB能降解苯；Cerqueira等[5]發(fā)現(xiàn)將多種能降解含油污泥的菌混合投加后降解效果有明顯的提高.

基于石油組分的復(fù)雜性及單菌株降解物質(zhì)的有限性，本文以中國石油化工集團(tuán)公司0#柴油為唯一碳源，通過分析單菌株及其混合菌的降解代謝產(chǎn)物來研究石油烴的降解機(jī)制，從而為篩選功能微生物提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種來源

(1)居植物柔武士菌(Raoultellaplanticola)，在 GenBank中序列登錄號為KC753502，以下簡稱為R.planticola.

(2)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，在GenBank中序列登錄號為KC753507，以下簡稱為S.marcescens.

(3)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，在GenBank中序列登錄號為KC753503，以下簡稱為B.cereus.

(4)克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)，在GenBank中序列登錄號為KC753504，以下簡稱為K.variicola.

上述4株單菌，由本實驗室從中國石油長慶石化公司附近的油泥中分離篩選鑒定所得.混合菌按照前期響應(yīng)面優(yōu)化混合菌配比實驗結(jié)果配制，其中R.planticola、S.marcescens、B.cereus、K.variicola等的高濃度菌液(OD590=0.5)分別按接種量4%、2%、2%、2%等的比例組合.

1.2 培養(yǎng)基

(1)原油培養(yǎng)基[6]：(NH4)2SO45 g，KCl 1.1 g，NaCl 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.028 g，KH2PO41.5 g，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，微量元素 5 mL，蒸餾水1 L，柴油 10 g，調(diào)pH 7.2，121 ℃滅菌20 min.

微量元素液成分( g· L-1) 包括ZnSO4·7H2O 0.29 g，CaCl20.24 g，CuSO4·5H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.17g.

(2)富集培養(yǎng)基[7]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g， NaCl 10 g，蒸餾水1 L，調(diào)pH 為7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.3 降解率的測定

將4單菌株及其混合菌制成菌懸液，以相同接種量加入到100 m L 原油培養(yǎng)基中，做3個平行試驗，放入30 ℃搖床中( 轉(zhuǎn)速為120 r·min-1) 培養(yǎng)5天，然后用重量法測定殘余柴油的含量[8].以不接菌的培養(yǎng)液為對照，用四氯化碳回收殘余原油，濾液過濾到已稱重的圓底燒瓶中，除去菌懸液，旋蒸后干燥，稱重，采用如下計算公式：

降解率=(m1-m2)/m1×100%

式中：m1為對照組的殘油質(zhì)量，g；m2為樣品殘油質(zhì)量，g.

1.4 殘油組分GC-MS分析

將殘油萃取液用CCl4定容至100 mL，取1 mL移至進(jìn)樣瓶中用于GC-MS檢測.GC-MS運行條件為：

(1)色譜條件[9]

色譜柱為 HP-5 ms 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；載氣：He；進(jìn)樣模式：分流,分流比為 50∶1；采樣時間：1.00 min；柱前壓：8.2 psi;進(jìn)樣口溫度：250 ℃；起始溫度：60 ℃，保持 2.0 min，以 20.0 ℃·min-1升至 300 ℃，保持 10 min；進(jìn)樣量 1μL.

(2)質(zhì)譜條件

傳輸線溫度：250 ℃；阱溫：220 ℃；電離方式：EI；電離能：70 eV；掃描模式：全掃描；掃描質(zhì)量范圍：2～1 050 amu.

2 結(jié)果與討論

2.1 單菌株和混合菌的降解比較

以柴油為唯一碳源，在5天的降解實驗中,各單菌株及混合菌對柴油降解效率如圖1所示,依次為：混合菌>K.variicola>B.cereus>S.marcescens>R.planticola.在投加單一菌時，R.planticola、S.marcescens、B.cereus、K.variicola等的降解率均不高，分別為41.83%、48.39%、49.29% 和54.87%.混合菌的降解率為64.27%，比單菌株降解更為有效.

實驗所用的柴油成分復(fù)雜，包括烷烴、烯烴、環(huán)烷烴、芳香烴和多環(huán)芳烴等.一種細(xì)菌可能只對其中的某種或有限的幾種組分起作用，因而對不同類污染物的利用具有一定的局限性.Mukred 等[10]研究表明,混合菌能降解長鏈脂肪族化合物,而單菌株只能降解短鏈或中長鏈的脂肪族化合物;葉淑紅等[11]發(fā)現(xiàn)混合菌在石油烴的降解中能夠充分發(fā)揮各菌種之間的協(xié)同作用，比單菌株降解更為有效.

因此，為了更深入地了解單菌株及混合菌在降解石油烴中發(fā)揮的作用及其降解途徑，本論文對單菌株及混合菌培養(yǎng)5天后的降解產(chǎn)物進(jìn)行了GC-MS分析.

圖1 單菌株及混合菌對柴油的降解

2.2 降解代謝產(chǎn)物分析

經(jīng)GC-MS分析,得到了單菌株及混合菌降解產(chǎn)物總離子流色譜圖(見圖2所示).氣相色譜分離后的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)過質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，并查對有關(guān)質(zhì)譜和氣相色譜資料，綜合各項分析并對各色譜峰加以確認(rèn).選定的不加菌對照組的6種主要組分如圖2(a)所示，以此來研究單菌株及混合菌對柴油的降解途徑.

2.2.1 支鏈烯醇的降解

微生物降解直鏈烷烴時，可對單末端、雙末端和次末端進(jìn)行氧化.降解過程為:石油降解菌將直鏈烷烴氧化為醇，醇經(jīng)過脫氫酶氧化變?yōu)槿┭趸優(yōu)橹舅?，脂肪酸通過β-氧化降解為乙酰輔酶A，后者或進(jìn)入三羧酸循環(huán)，分解成CO2和H2O，并釋放出能量，或進(jìn)入其他生化過程[12].

支鏈烷烴與直鏈烷烴降解途徑相似.但相對于直鏈烷烴而言，支鏈的存在會增加微生物氧化降解的阻力.這是因為氧化分解的部位主要是在直鏈上發(fā)生，而靠近側(cè)鏈的一端較難發(fā)生氧化反應(yīng).烷烴的支鏈降低了分解速率，使含有支鏈結(jié)構(gòu)的烴類降解速度慢于相同碳數(shù)的直鏈烴類[13].

(a) 不加菌對照組圖譜 (b) R.planticola降解產(chǎn)物圖譜

(c) S.marcescens降解產(chǎn)物圖譜 (d) B.cereus降解產(chǎn)物圖譜

(e) K.variicola降解產(chǎn)物圖譜 (f) 混合菌降解產(chǎn)物圖譜圖2 單菌株及混合菌降解產(chǎn)物GC-MS圖譜

針對圖2(a)中11.615 min出現(xiàn)帶有甲基支鏈的Z,Z-2-甲基-3,13-十八碳二烯醇(2-Methyl-Z,Z-3,13-octadecadienol),經(jīng)過5天培養(yǎng)，在R.planticola和K.variicola降解產(chǎn)物中只發(fā)現(xiàn)(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-).故可推測支鏈烯烴醇的微生物降解途徑與支鏈烷烴相似，可能先脫除甲基的支鏈，減少微生物氧化降解阻力，然后使原來靠近側(cè)鏈一端的羥基能發(fā)生與直鏈烷烴相似的氧化途徑，氧化為羧基并產(chǎn)生某些雙鍵的位移.當(dāng)混合菌中發(fā)現(xiàn)中間產(chǎn)物Z,E-3,13-十八碳二烯醇(Z,E-3,13-Octadecadien-1-ol)時，可以肯定R.planticola和K.variicola具有脫烷基作用，能加速石油中支鏈烴的降解.

2.2.2 (Z)-9-十八烯醛的降解

由圖2(c)15.060 min和圖2(d)14.735 min降解產(chǎn)物中丙二醇-油酸酯(Propyleneglycol monoleate)的出現(xiàn)可知，S.marcescens、B.cereus及混合菌等具有把醛基氧化為羧酸的功能.

2.2.3 烯烴的降解

對于水油兩相反應(yīng)，長鏈烯烴因其較差的水溶性而使反應(yīng)活性較差，因此，通常利用表面活性劑形成的膠束作用來增加烯烴的水溶性，同時烯烴增溶到膠束中后，有利于在末端雙鍵參與配位而引入羰基[14].

不同微生物對1-十六碳烯(1-Hexadecene)降解程度不同.由圖2(c)14.206 min可知S.marcescens只能雙鍵發(fā)生位移生成內(nèi)烯烴的中間產(chǎn)物(順-11-十六碳烯醛)；圖2(b)13.936 min發(fā)現(xiàn)R.planticola能在此基礎(chǔ)上繼續(xù)脫氫生成二烯烴中間產(chǎn)物(順，順-7,10-十六碳二烯醛)；分別在圖2(d)、圖2(e)和圖2(f)中依次有B.cereus、K.variicola及混合菌能生成終產(chǎn)物15-甲基-11-十六烯酸甲酯.單菌株與混合菌降解產(chǎn)物都被引入羰基，說明可能存在表面活性劑的促進(jìn)作用，這與前期研究4種單菌株都具有較強的產(chǎn)表面活性劑能力相符[15].

Schink[16]在不飽和烴的厭氧降解開拓性研究中，檢測到了1-十六碳烯礦化產(chǎn)物醋酸鹽.這與本研究中B.cereus降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)乙酸酐相類似.Grossi等[17]發(fā)現(xiàn)在硫酸鹽還原菌(D.aliphaticivorans)厭氧作用下會氧化1-十六碳烯C-1處的雙鍵形成伯醇，并在C-2，C-3，或在飽和端近頂端碳[C-(ω-1)]上增加碳單元形成帶甲基的支鏈.在降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)B.cereus和K.variicola能使終產(chǎn)物近頂端碳甲基化，可說明B.cereus和K.variicola可能有厭氧條件下降解1-十六碳烯的潛力.

1-十九碳烯(1-Nonadecene)能分別在R.planticola、S.marcescens及K.variicola等作用下轉(zhuǎn)化為Z-4-十九烯醇乙酸酯(Z-4-Nonadecen-1-ol acetate).這說明上述單菌株可能先將烯烴代謝為不飽和醇后產(chǎn)生某些雙鍵的位移.但在圖2(d)和圖2(f)中沒有發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物，可能是由于B.cereus的抑制作用導(dǎo)致，混合菌中沒有發(fā)現(xiàn)1-十九碳烯降解.

2.2.4 炔烴的降解

Tavassoli等[18]利用原油中分離的微生物降解瀝青質(zhì)，培養(yǎng)20天后,瀝青質(zhì)紅外光譜分析中C≡C峰消失.而本研究中圖2(e)14.470 minK.variicola及圖2(f)15.217 min混合菌培養(yǎng)5天后其降解產(chǎn)物中都發(fā)現(xiàn)有Z-6-十五烯醇-乙酸酯，而其它單菌株中未發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物.這說明K.variicola可以用于短期內(nèi)降解瀝青質(zhì)，減輕油田生產(chǎn)過程中瀝青質(zhì)引起的堵塞油井、出油管線及地面設(shè)施等現(xiàn)象.

2.2.5 環(huán)烷烴的降解

環(huán)烷烴在石油餾份中占有較大比例.對于不含支鏈的環(huán)烷烴的降解，其與鏈烴的次末端降解途徑相似：首先氧化產(chǎn)生環(huán)烷醇，接著脫氫得酮，然后氧化得內(nèi)酯，或直接開環(huán)，生成脂肪酸[19].實際上，B.cereus和K.variicola純培養(yǎng)5天后降解圖譜檢測出13-十四碳烯-1-醇乙酸酯,如圖2(d)14.167 min和圖2(e)14.156 min所示.可推測環(huán)十四烷先被氧化成環(huán)烷醇，然后在臨近的β位發(fā)生C-C鍵斷裂形成烯醇，接著與游離的醋酸形成酯鹽.混合菌中可能受到環(huán)烷烴的抑制作用而未發(fā)現(xiàn)此降解產(chǎn)物.

單菌株及混合菌對6種物質(zhì)的降解情況，如表1所示.K.variicola可以降解列舉物質(zhì)中的5種，屬于優(yōu)勢菌種.單菌株及混合菌株對1-十六碳烯都有一定程度地降解，B.cereus和混合菌中卻未發(fā)現(xiàn)1-十九碳烯降解產(chǎn)物，這說明同種類型烯烴中，分子量越大越難被微生物利用.

表1 單菌株及混合菌對6種物質(zhì)降解情況

注：—— 表示未發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物; ***表示中間體.

3 結(jié)論

在以柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基中，K.variicola是優(yōu)勢菌種，培養(yǎng)5天降解率高達(dá)54.87%；R.planticola降解率最低，僅為41.83%；混合菌株降解率為64.27%，相比單菌株的降解率，有明顯地提高.

從4種單菌株及混合菌不同程度地降解1-十六碳烯可知，1-十六碳烯的氧化代謝途徑為：菌株首先把1-十六碳烯末端氧化并產(chǎn)生雙鍵位移，生成順-11-十六碳醛或順-7-十六碳醛，然后經(jīng)歷脫氫酶作用生成順，順-7,10-十六碳二烯醛，最后被氧化和甲基化為15-甲基-11-十六烯酸甲酯.

不同微生物對不同石油烴的成分具有不同的降解能力.R.planticola和K.variicola具有脫烷基功能，對一定的支鏈烴有降解效果；S.marcescens和B.cereus能氧化不飽和醛基；R.planticola和S.marcescens只能初步氧化1-十六烯，而B.cereus和K.variicola可以氧化1-十六烯為終產(chǎn)物羧酸；R.planticola、S.marcescens和K.variicola可以降解1-十九碳烯；K.variicola可以降解炔烴，其它3種單菌株均無此功能；B.cereus和K.variicola可以降解環(huán)烷烴.

[1]Shah K.Petroleum hydrocarbon pollution and its biodegradation[J].International Journal of Chemtech Applications,2013,2(3):63-68.

[2]Kiesele L U.Efficient and cost-effective purification of groundw ater polluted by polycyclic aromatic hydroearbons experience with a cokeplant hazardous waste site[J].Altlasten Spektrum,1997,6(5):214-217.

[3]Yi T,Lee E H,Ahn Y G,et al.Novel biodegradation pathways of cyclohexane by rhodococcus sp.EC1[J].Journal of Hazardous Materials,2011,191(1):393-396.

[4]Chakraborty R,O Connor S M,Chan E,et al.Anaerobic degradation of benzene,toluene,ethylbenzene,and xylene compounds by Dechloromonas strain RCB[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(12):8 649-8 655.

[5]Cerqueira V S,Hollenbach E B,Maboni F,et al.Biodegradation potential of oily sludge by pure and mixed bacterial cultures[J].Bioresource Technology,2011,102(23):11 003-1 1010.

[6]王 鑫,郭書海,孫鐵珩,等.稠油高效降解菌的降解特性及其應(yīng)用[J].環(huán)境工程學(xué)報,2009,3(4):586-590.

[7]肖 兵,楊德玉,史榮久,等.一株高效表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及其活性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)[J].生態(tài)學(xué)雜志,2013,32(3):779-786.

[8]崔志松,鄭 立,楊佰娟,等.兩種海洋專性解烴菌降解石油的協(xié)同效應(yīng)[J].微生物學(xué)報,2010,50(3):350-359.

[9]Zhang L,Shen C,Liu R.GC-MS and FI-IR analysis of the bio-oil with addition of ethyl acetate during storage[J].Bioenergy and Biofuels,2014,2(3):1-6.

[10]Mukred A M,Hamid A A,Hamzah A,et al.Development of three bacteria consortium for the bioremediation of crude petroleum-oil in contaminated Water[J].OnLine Journal of Biological Sciences,2008,8(4):73-79.

[11]葉淑紅,丁 鳴,馬 達(dá),等.微生物修復(fù)遼東灣油污染濕地研究[J].環(huán)境科學(xué),2005,26(5):143-146.

[12]宋志文,夏文香,曹 軍.海洋石油污染物的微生物降解與生物修復(fù)[J].生態(tài)學(xué)雜志，2014，23(3)：99-102.

[13]張信芳.海洋石油污染的微生物降解過程及生態(tài)修復(fù)技術(shù)展望[J].環(huán)境科學(xué)與管理,2012,37(5)：97-99.

[14]何珍紅,侯震山,王永壘,等.水溶性鈀膦絡(luò)合物催化 1-辛烯的氫羧基化反應(yīng)[J].分子催化,2011,25(5):406-414.

[15]花 莉,洛晶晶,彭香玉,等.產(chǎn)表面活性劑降解石油菌株產(chǎn)物性質(zhì)及降解性能研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報,2013,22(12):1 945-1 950

[16]Schink B.Degradation of unsaturated hydrocarbons by methanogenic enrichment cultures[J].FEMS Microbiology Letters,1985,31(2):69-77.

[17]Grossi V,Cravo Laureau C,Méou A,et al.Anaerobic 1-alkene metabolism by the alkane-and alkene-degrading sulfate reducer desulfatibacillum aliphaticivorans strain CV2803T[J].Applied and environmental microbiology,2007,73(24):7 882-7 890.

[18]Tavassoli T,Mousavi S M,Shojaosadati S A,et al.Asphaltene biodegradation using microorganisms isolated from oil samples[J].Fuel,2012,93:142-148.

[19]張光軍,方 萍.紅球菌在石油烴類物質(zhì)降解中的作用[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2013,36(2)：93-99.