葛杰，陳虎，劉超，蘇豫梅

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

水解超高產(chǎn)大豆“中黃35”功能性蛋白的制備

葛杰，陳虎，劉超，蘇豫梅

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

以新疆超高產(chǎn)大豆“中黃35”品種為研究對(duì)象，采取傳統(tǒng)提取、酶單因素實(shí)驗(yàn)和雙酶解法等多種方法制備大豆的功能性蛋白，并對(duì)其SDS－PAGE電泳、溶解曲線、氮溶指數(shù)和濁度等基本性質(zhì)進(jìn)行了初步分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明“中黃35號(hào)”大豆蛋白的提取最優(yōu)條件是:豆水比(g:mL)為1∶13，pH值為8，提取時(shí)間為2 h。酸性蛋白酶水解大豆蛋白的最適合工藝條件為:初始pH值為3.5，溫度為45℃，酶用量為6%，固液比為1∶8，水解時(shí)間為8 h。采用SDS－PAGE電泳分離出2條酸性蛋白條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量分別在95 kD和60 kD左右。

大豆;功能性蛋白;雙酶解法;酸性蛋白

大豆是新疆的主栽農(nóng)作物之一。大豆蛋白含有多種氨基酸成分，特別是含有人體所必需的8種氨基酸，是一類優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源。超高產(chǎn)大豆“中黃35”在新疆于2006、2007年創(chuàng)造的產(chǎn)量分別達(dá)5 197 kg/hm2和5 577 kg/hm2，2010年在兵團(tuán)農(nóng)八師148團(tuán)試驗(yàn)田更是達(dá)到6 088.35 kg/hm2的超高產(chǎn)指標(biāo)。有研究表明:植物蛋白的結(jié)構(gòu)大都十分緊密，相對(duì)分子質(zhì)量較大，不易被人體消化吸收，吸收率也往往低于動(dòng)物蛋白;大豆蛋白在酸性條件下(pH值為3.0～4.5)溶解性很差，而酸性飲料的pH值正好在此區(qū)間。大豆的蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%，且含有豐富的不飽和脂肪酸、鈣、磷、鐵、膳食纖維等，不含膽固醇，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但目前大豆蛋白質(zhì)的提取率較低，大多在60%以下。80%～88%的大豆蛋白可溶于水。將大豆蛋白水解后，其相對(duì)分子質(zhì)量減小，結(jié)構(gòu)疏松，更有利于通過(guò)人體內(nèi)酶的作用使吸收率大大提高。目前，關(guān)于新疆大豆蛋白在酸性條件下的應(yīng)用研究不多，特別是對(duì)不同方法處理后超高產(chǎn)大豆其酸性蛋白的生理生化性質(zhì)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用超高產(chǎn)大豆“中黃35”品種，研究大豆分離蛋白制備方法，旨在提高大豆蛋白質(zhì)的提取率，研究大豆蛋白質(zhì)的溶解性受原料加熱處理、溶出時(shí)的固液比、pH值、溫度等條件的影響，優(yōu)化大豆蛋白的提取工藝，制備大豆功能性蛋白并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

采用雙酶解法研制功能性可溶蛋白，利用SDS－PAGE電泳分析其酸性蛋白的分子量，為功能性大豆蛋白系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)和方法的指導(dǎo)，使其應(yīng)用范圍更加廣泛。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新疆超高產(chǎn)大豆“中黃35號(hào)”。

1.2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

選用伊犁地區(qū)伊寧縣吉里于孜鎮(zhèn)種植推廣的“中黃35號(hào)”大豆品種，于2012年5月6日播種，每公頃施用150 kg氮磷鉀復(fù)合肥作為種肥，初花期每公頃追施150 kg尿素。

1.3 測(cè)定方法

1)用傳統(tǒng)方法分離大豆蛋白。蛋白質(zhì)提取率=(漿料中蛋白質(zhì)總量/原料中蛋白質(zhì)總量)× 100%。采用不同的浸泡pH值、磨漿溫度、豆水比和磨漿pH值，試驗(yàn)優(yōu)化大豆材料的最佳磨漿工藝。

2)用雙酶解法研制功能性可溶蛋白。根據(jù)pH值適用范圍(酸性、中性)，采用2種酶聯(lián)合水解，分別添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶，比較大豆蛋白的水解率大小以確定最優(yōu)加酶解體系。

3)大豆酸性蛋白氮溶指數(shù)的測(cè)定。采用Lorry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

4)大豆酸性蛋白溶解度曲線及濁度的測(cè)定。

5)SDS－PAGE電泳分析大豆酸性蛋白分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)方法分離大豆蛋白。

傳統(tǒng)提取方法是采用堿溶酸沉淀法。將脫脂后的低溫大豆在堿性條件下溶解，pH值控制在7.5～8.0左右，離心取清液;然后pH值控制在4.5，在酸性條件下讓蛋白沉淀，離心取沉淀;再將pH值控制在7.0～7.5左右，所得的凝乳漿在中性條件下溶解，最后噴霧干燥得到成品大豆分離蛋白。

試驗(yàn)表明“中黃35號(hào)”大豆蛋白的提取的最優(yōu)條件是:豆水比為1∶13，pH值為8，提取時(shí)間為2 h。大豆蛋白的等電點(diǎn)為4.5～5.0，是酸性蛋白。盡管大豆中含有水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白和醇溶蛋白，但其主要成分為堿溶蛋白。丙酮可降低溶液的介電常數(shù)，破壞蛋白質(zhì)的水化膜，可使蛋白質(zhì)在一定條件下沉淀析出;調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值到等電點(diǎn)附近，有利于蛋白質(zhì)的沉淀。大豆總蛋白曲線見(jiàn)圖1。

2.2 雙酶解法研制功能性可溶蛋白

稱取已提取的大豆蛋白100 g，加入去離子水1.5 L，調(diào)pH值為8.0后充分?jǐn)嚢琛? h后9 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液調(diào)pH值為4.5，此時(shí)溶液出現(xiàn)乳白色沉淀。將溶液9 000 r/min、4℃離心20 min，取沉淀，加入10倍(10 mL/g)的去離子水，調(diào)pH值為7.0。待沉淀完全溶解后調(diào)pH值為4.0～6.0，加入適量植酸酶，30～40℃下水浴振蕩30 min，90℃高溫滅酶10 min。調(diào)pH值為3.0～6.0，加入蛋白酶適量，30～40℃下酶解30 min，90℃高溫滅酶10 min，然后高溫高壓處理15 min，噴霧干燥，得成品功能性大豆蛋白－酸性蛋白。制備的蛋白如圖2所示。

圖1 “中黃35號(hào)”大豆總蛋白曲線

圖2 “中黃35”大豆酸性蛋白的制備

隨著酶用量的增大，水解液中的氨基氮含量升高。酶用量超過(guò)8%以后，大豆蛋白質(zhì)含量略有下降。這主要是由于酶濃度過(guò)大，發(fā)生自溶(自水解)現(xiàn)象，導(dǎo)致對(duì)底物的水解作用減弱，故取最適酶用量為8%。試驗(yàn)中先加中性蛋白酶，后加酸性蛋白酶，大豆蛋白水解率可達(dá)45%。

2.3 大豆酸性蛋白氮溶指數(shù)的測(cè)定

采用Lorry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定上清液蛋白濃度，氮溶指數(shù)為上清液蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

2.4 大豆酸性蛋白溶解度曲線的測(cè)定

測(cè)定蛋白分別在pH值為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時(shí)的氮溶指數(shù)，每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值，將各點(diǎn)連成折線即為溶解度曲線(表1和圖3)。

表1 “中黃35”大豆酸性蛋白溶解曲線表

圖3 “中黃35號(hào)”大豆酸性蛋白溶解曲線

2.5 大豆酸性蛋白濁度的測(cè)定

蛋白質(zhì)的濁度表征蛋白溶液外觀的透明程度。常見(jiàn)的用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)某特定波長(zhǎng)的光吸收進(jìn)行測(cè)量，吸光度越高，濁度就越大。試驗(yàn)中將功能性蛋白用去離子水配置成1%的溶液，磁力攪拌1 h，用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定其吸光值，結(jié)果如表2所示。

表2 “中黃35”大豆酸性蛋白濁度表

2.6 SDS-PAGE電泳分析大豆酸性蛋白分子量

凝膠電泳采用Laemmli法，在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)上進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，濃縮膠和分離膠的濃度分別為40 g/L和120 g/L，考馬斯亮藍(lán)R－250染色。還原電泳樣品緩沖液中含10 mmol/L β－巰基乙醇，其他成分與非還原SDS－PAGE電泳緩沖液相同。樣品濃度為2‰，上樣量為20 μL。采用SDS－PAGE電泳分離出2條酸性蛋白條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量分別在95 kD和60 kD左右，如圖4所示。

圖4 “中黃35”大豆酸性蛋白SDS－PAGE電泳分析

3 討論

大豆功能性蛋白質(zhì)的溶解性受原料加熱處理、溶出時(shí)的固液比、pH值、共存鹽類、溫度等條件的影響。有報(bào)道認(rèn)為:浸提時(shí)，加水量越多，蛋白質(zhì)的提取率就越高;但是加水太多，酸沉?xí)r蛋白的損失量增加;加水太少，大豆蛋白的溶出率大大下降，還會(huì)增加后續(xù)各工序的難度。蛋白質(zhì)的溶解度與浸提pH值有很大的關(guān)系。pH值太低時(shí)，蛋白組分解;pH值太高，易發(fā)生胱賴反應(yīng)，生成有毒物質(zhì)。溫度的高低對(duì)蛋白收率、純度及色澤有顯著影響。浸提溫度過(guò)高，會(huì)使蛋白變性，同時(shí)黏度增加，分離困難，耗能提高。筆者認(rèn)為浸提時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白的溶出率就越高;但一定的時(shí)間后，蛋白制得率隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而無(wú)顯著的變化。漿料粒度也被認(rèn)為是影響蛋白制備的一個(gè)因素，漿料粒度太細(xì)反而會(huì)使蛋白制得率和浸提效果下降，同時(shí)增加了過(guò)濾分離的難度。加酸速度和攪拌速度不容易控制，試驗(yàn)中到等電點(diǎn)時(shí)大豆蛋白質(zhì)凝集下沉緩慢，試管中上清液混濁。豆水比和浸泡pH值對(duì)大豆分離蛋白的提取率具有顯著影響。

大豆分離蛋白提取方法較多:①酸沉堿提法是一種傳統(tǒng)的分離提取方法，缺陷是耗酸、耗堿量大，廢水處理費(fèi)用高，產(chǎn)品收率低，但依然常用。②膜分離法，根據(jù)大豆蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大小、形狀及膜與大豆蛋白的適應(yīng)性，選擇膜材料對(duì)大豆蛋白提取液超濾分離、超濾凈化，噴霧干燥成粉狀大豆分離蛋白。③反膠束萃取分離法，利用反膠束技術(shù)從全脂豆粉萃取大豆蛋白，可一次萃取50%左右。大豆蛋白反膠束萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)明顯，主要是選擇性高、操作方便、放大容易，反膠束相可循環(huán)利用，分離和濃縮同步進(jìn)行;缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)在現(xiàn)有反膠束體系中穩(wěn)定性不高，易導(dǎo)致萃取前后蛋白質(zhì)的活性損失大，制約其工業(yè)化應(yīng)用。④反相高效液相色譜法，Tris(三甲基氨基甲烷緩沖劑)和2－巰基乙醇(分析級(jí))用于分離大豆蛋白。大豆蛋白分離樣本可用于組織化蛋白、大豆粉、豆奶、強(qiáng)化嬰兒大豆的生產(chǎn)，使用前均要測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。樣品溶于水，然后于注樣前用0.122 μm經(jīng)無(wú)菌處理的多酚濾紙過(guò)濾。全部樣品和標(biāo)樣保存在3℃或冰凍條件下。樣品溶液在分析當(dāng)天現(xiàn)配，并保存在冰上備用。

4 結(jié)論

“中黃35號(hào)”大豆蛋白的提取的最優(yōu)條件是:豆水比為1∶13，pH值為8，提取時(shí)間為2 h。酸性蛋白酶水解大豆蛋白的最適工藝條件為:初始pH值為3.5，溫度為45℃，酶用量為6%，固液比為1∶8，水解時(shí)間為8 h。采用SDS－PAGE電泳分離出2條酸性蛋白條帶，其分子量分別在95 kD和60 kD左右。該試驗(yàn)數(shù)據(jù)為加強(qiáng)超高產(chǎn)大豆深加工中的研究開(kāi)發(fā)，提高農(nóng)副產(chǎn)品的附加值，以及對(duì)功能性大豆蛋白系列產(chǎn)品的進(jìn)一步研究提供了一定的理論依據(jù)和方法的指導(dǎo)。

［1］王志民.水解動(dòng)物蛋白的酶法制備及應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，1998(5):12－14.

［2］程潤(rùn)達(dá)，張淑茹.提高分離蛋白得率的研究［J］.食品科學(xué)，1998，19(7):14－17.

［3］梁歧.溫度、水分對(duì)大豆組織化蛋白物理性能的影響［J］.食品科學(xué)，2000，2:39－40.

［4］Laurent B.Electroacidification of Sobean proteins for production of isolate［J］.Food Chemistry，1997，9:52－56.

［5］王莉娟，陶文沂.大豆肽體外抗氧化活性研究［J］.生物加工過(guò)程，2008，6(4):69－73.

［6］劉靜，陳均志.大豆多肽分離純化方法研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(9):171－174.

［7］盧亞萍，馮杰.大豆多肽的性質(zhì)及其研究進(jìn)展［J］.飼料添加劑，2005，7:26－29.

［8］蒲首垂，王金水.酶解蛋白制備生物活性肽進(jìn)展［J］.糧食與油脂，2005(3):17.

［9］梁鐵，工燕燕，張陳.楊梅黃酮降血脂作用研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(12):37－39.

［10］Zhang B，Li QX，Li LL，et al.Effects of soybean small Peptides on nitrogen balance，nutrient digestibility and several indices in the Portal Veinous Plasma of goats［J］.Small Ruminant Researeh，2007，72:1－10。

［11］崔鳳霞.海參膠原蛋白生化性質(zhì)及膠原肽活性研究［J］.青島:中國(guó)海洋大學(xué)，2007.

(責(zé)任編輯 何杰玲)

Hydrolyzed Soy Protein“Medium Yellow 35”Functional Preparation

GE Jie，CHENG Hu，LIU Chao，SU Yu－mei
(College of Agricultural Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)

This experiment adopts the super－h(huán)igh－yield“medium yellow 35”soybean varieties in Xinjiang，and adopts the traditional extraction，enzymatic methods such as single factor experiment and double enzyme hydrolysis to obtain the functional protein.The functionality to the preparation of soybean protein，and its biochemical properties include the SDS－PAGE electrophoresis，dissolve curve，nitrogen solubility index and basic properties such as turbidity has carried on the preliminary analysis.Experiments prove that the most optimum extraction conditions for“medium yellow 35”soy protein function are that soybean water ratio is 1∶13，with pH of 8，and extracting time 2 h.The optimum technological condition:initial pH is of 3.5，with temperature of 45℃，dosage of enzyme is of 6%，and solid－to－liquid ratio is 1∶8，and extracting time 8 h.The molecular weights of two acidic proteins are 95 kD and 60 kD respectively by SDS－PAGE.

soybean;functional protein;double enzyme hydrolysis;acidic protein

TS201

A

1674－8425(2014)05－0063－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.05.013

2013－12－18

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目“酶解法制備大豆中黃35號(hào)酸性蛋白及在蘋(píng)果醋中的應(yīng)用”(jqzyp62012154)

葛杰(1978—)，女，新疆烏魯木齊人，講師，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。

葛杰，陳虎，劉超，等.水解超高產(chǎn)大豆“中黃35”功能性蛋白的制備［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014(5):63－66.

format:GE Jie，CHENG Hu，LIU Chao，et al.Hydrolyzed Soy Protein“Medium Yellow 35”Functional Preparation［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(5):63－66.