張普宏，馮 鋼，高家林，浦 春，章 堯

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 內(nèi)分泌科，安徽 蕪湖 241001；3.皖南醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

糖尿病患者心血管并發(fā)癥是引起患者死亡的主要原因，而血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和損傷在糖尿病血管病變的發(fā)病中扮演著關(guān)鍵角色[1-3]。研究表明高血糖可增強(qiáng)氧化應(yīng)激作用及減少抗氧化作用而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能紊亂[4]。高血糖引起的糖基化終末產(chǎn)物可中斷血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂周期，抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-7]。由于外周血中的血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于活化或損傷的血管內(nèi)皮，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)的增多可出現(xiàn)在血管損傷等多種病理情況下，如心血管疾病，感染性脈管炎和2型糖尿病等[8-10]，因此CECs被認(rèn)為是一種血管損傷的標(biāo)志物[11]。

CD146最初從黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是一種Ca2+非依賴性細(xì)胞粘附分子，屬于免疫球蛋白超家族(Igsf)成員，表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種惡性腫瘤。CD146參與細(xì)胞與細(xì)胞間的局部粘連、聚集、細(xì)胞骨架的重組、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持，以及調(diào)控細(xì)胞游走和增殖等過(guò)程。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，外周血中表達(dá)CD146的細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞以及CECs[12-16]。本研究旨在通過(guò)定量檢測(cè)外周血CD146 mRNA評(píng)估2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，探討2型糖尿病患者外周血CD146 mRNA水平和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、血糖控制等指標(biāo)間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究包括48例2型糖尿病患者和32例正常對(duì)照者。2型糖尿病患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)糖尿病診斷指南2010(HbA1c≥6.5%)[17]。正常對(duì)照者沒(méi)有明顯用藥史，空腹及餐后血糖正常。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：未控制的高血壓(BP>140/90 mmHg),活動(dòng)性炎癥，感染性疾病，動(dòng)脈粥樣硬化病史(冠心病，周圍性血管疾病，頸動(dòng)脈性疾病)，服用擾亂血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物，如阿司匹林、降血脂藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑，吸煙，妊娠，哺乳期[18]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 可溶性E選擇素(sE-selectin)的測(cè)定 采用ELISA法測(cè)定血漿可溶性E選擇素濃度，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)(R&D)進(jìn)行。

1.2.2 谷胱甘肽(GSH)的測(cè)定 按照Hu等描述的方法測(cè)定血漿GSH的濃度[19]。血漿加入Tris-EDTA混勻后在412 nm吸光度處測(cè)定，測(cè)定值標(biāo)記為A1。然后，在混合物中加入二硫代二硝基苯甲酸，暗箱孵化15 min后在412 nm吸光度處測(cè)定，測(cè)定值標(biāo)記為A2。按照公式(A2-A1)×1.57計(jì)算出GSH的值，單位為μmol/L。

1.2.3 RNA的提取 采用QIAamp RNA Blood Mini Kit(Qiagen)從新鮮的全血中提取總RNA。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，用核酸定量?jī)x測(cè)定提取總RNA濃度,A260/A280比值在 1.8～2.0,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 mRNA的測(cè)定 采用SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)，將經(jīng)DNA酶處理后的RNA(100 ng)反轉(zhuǎn)錄(RT)為cDNA并保存于-20°C。用Oligo Primer Analysis Software v.7軟件設(shè)計(jì)CD146基因引物，上游：5′-CCTGGAACGTCAACGGCAC-3′,下游：5′-GGGTGGGTTAAATTGACCAGCTCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度177 bp，Tm 52°C。內(nèi)參beta-actin基因引物，上游：5′ACCGAGCGCGGCTACAGC-3′，下游：5′-CTCATTGCCAATGGTGAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度180 bp，Tm 53°C。PCR采用ROCHE LightCycler 480-II擴(kuò)增儀，反應(yīng)體系中包含100 ng引物及12.5 μl SYBR Green PCR混合液(QIAGEN)，總體積25 μl。PCR程序如下：95°C 10 s、94°C 5 s、58°C 15 s、72°C 15 s，40個(gè)循環(huán)；72°C 30 s。產(chǎn)物溶解曲線分析程序?yàn)?5℃ 15 s,60℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用Relative Quantification檢測(cè)模式，軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病組和正常對(duì)照組臨床指標(biāo)的比較 2型糖尿病組和正常對(duì)照組的年齡、性別和血壓的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2型糖尿病組外周血CD146 mRNA水平和血漿sE-selectin濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；而2型糖尿病組GSH明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 2型糖尿病組和正常對(duì)照組臨床指標(biāo)比較Tab 1 Clinical indicators measured in the T2DM patients and healthy

2.2 CD146 mRNA與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 CD146 mRNA 和 HbAlc呈正相關(guān)(r=0.639 5,P<0.05;圖 1)， CD146 mRNA 和 sE-selectin也呈正相關(guān) (r=0.658 0,P<0.05;圖 2)，而CD146 mRNA 和 GSH之間未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是導(dǎo)致糖尿病患者血管病變的重要原因之一，因此準(zhǔn)確評(píng)估血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂對(duì)于降低糖尿病患者心血管并發(fā)癥具有重要的臨床意義。血漿sE-selectin是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的一種細(xì)胞粘附分子，sE-selectin可用于血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及損傷程度的評(píng)估。我們發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血漿sE-selectin濃度顯著高于正常對(duì)照者，證明2型糖尿病患者存在血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[20]。2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能紊亂與高血糖引起的氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)和抗氧化作用減低相關(guān)。GSH作為一種抗氧化劑，可阻止氧自由基對(duì)細(xì)胞內(nèi)重要結(jié)構(gòu)的損傷，我們的研究也證實(shí)了2型糖尿病患者GSH顯著低于正常對(duì)照者[21-22]。

Lombardo等發(fā)現(xiàn)2型糖尿病并不影響患者的骨髓動(dòng)員，但是可顯著減少成熟骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的數(shù)量，而成熟EPCs數(shù)量的改變可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，引起外周血CECs增多[23]。Kotb等發(fā)現(xiàn)CECs參與了2型糖尿病患者心血管病變等過(guò)程，證明CECs是一種2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及疾病控制情況的標(biāo)志物[24]。

CD146表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，參與細(xì)胞間的局部粘連、聚集、細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)維持等過(guò)程[25-26]。在正常對(duì)照者外周血中，CD146 mRNA主要來(lái)源于淋巴細(xì)胞。由于高血糖增強(qiáng)了氧化應(yīng)激作用、減少了抗氧化作用而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂，因此在2型糖尿病患者外周血中，除了淋巴細(xì)胞，CECs也是CD146 mRNA的重要來(lái)源。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了2型糖尿病組外周血CD146 mRNA水平顯著高于正常對(duì)照組。

Lorenzi等發(fā)現(xiàn)持續(xù)性高糖血癥可明顯延長(zhǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及損傷[27]。在2型糖尿病患者中，相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CD146 mRNA和HbA1c明顯相關(guān)，表明血糖控制不佳的2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和損傷的程度較重，并且相關(guān)分析還發(fā)現(xiàn)CD146 mRNA和sE-selectin也存在明顯的相關(guān)性。由于GSH減低加重血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷主要是通過(guò)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，因此，在2型糖尿病患者中，相關(guān)分析未發(fā)現(xiàn)CD146 mRNA和GSH之間存在顯著的相關(guān)性。

綜上所述，通過(guò)測(cè)定2型糖尿病患者外周血CD146 mRNA水平可評(píng)估血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和損傷程度，外周血CD146 mRNA可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和損傷的生物標(biāo)記物。

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