唐 軍，張鵬程，汪和貴,柯永勝

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 心內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

冠脈微栓塞(coronary microembolization，CME)來(lái)自冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的易損斑塊，是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)等血運(yùn)重建術(shù)常見(jiàn)的并發(fā)癥，引起冠脈內(nèi)“慢血流”或“無(wú)復(fù)流”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[1]。研究報(bào)道[2-4]，通心絡(luò)具有抗血栓、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善微循環(huán)及減輕心肌損傷等作用，但其在冠脈微栓塞中的作用研究較少，且機(jī)制尚未闡明。因此，本研究通過(guò)制備兔冠脈微栓塞模型，觀察術(shù)前頓服負(fù)荷量通心絡(luò)干預(yù)對(duì)冠脈微栓塞兔心肌損傷的影響、對(duì)血清炎癥因子TNF-α、IL-1β水平及心肌組織TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響，初步探討通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用負(fù)荷量通心絡(luò)治療冠狀動(dòng)脈微栓塞提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性新西蘭白兔40只，體質(zhì)量1.6～2.3 kg，南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證號(hào)：2017298。

1.2 藥物和試劑 阿司匹林腸溶片(拜阿司匹林)，0.1 g/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)；阿托伐他汀鈣片(立普妥)，20 mg/片，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)；通心絡(luò)超微粉：河北以嶺藥業(yè)生產(chǎn)。TNF-α，IL-1β定量ELASA測(cè)定試劑盒，上海藍(lán)基生物科技有限公司提供。心肌肌鈣蛋白Ⅰ檢測(cè)試劑盒(cTnI)，北京康思潤(rùn)業(yè)生物技術(shù)有限公司提供；羊抗兔TNF-α單克隆抗體(濃縮型)，工作濃度為1∶80；羊抗兔IL-1β單克隆抗體(濃縮型)。即用型免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色試劑盒等購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 病理組織包埋機(jī)：日本SAKURA FINETECHNICAL CO.LTD，4590型。病理組織切片機(jī)：德國(guó)萊卡公司，1512型。病理圖像分析儀：德國(guó)萊卡公司，DMR+550型。生物組織自動(dòng)脫水機(jī)TS-12F：湖北孝宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司。DH-150型小動(dòng)物人工呼吸機(jī)：浙江大學(xué)醫(yī)療儀器設(shè)備廠。722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海楚定分析儀器有限公司。銳普熒光干式cTnI定量分析儀：北京康思潤(rùn)業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備及分組 根據(jù)月桂酸鈉制作急性冠脈微栓塞模型方法[5-6]，新西蘭兔稱重后取仰臥位固定,以4.0 ml/kg在耳緣靜脈靜推20%烏拉坦麻醉，于頸部正中常規(guī)消毒后切開(kāi)皮膚暴露氣管，再橫向切開(kāi)氣管，插入套管連接小型動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣。取左前外側(cè)中心切口入胸腔，逐層分離暴露至心臟及主動(dòng)脈根部，鉗夾升主動(dòng)脈后立即用注射器將胰島素40 U從心尖部直接注入左心室，待回血后注入月桂酸鈉2.0 mg/kg(濃度2 mg/ml)，假手術(shù)組注射等量的生理鹽水。夾閉20 s后，松開(kāi)血管夾，心跳穩(wěn)定后逐層關(guān)閉胸腔。術(shù)中監(jiān)測(cè)心電監(jiān)護(hù)可見(jiàn)ST-T壓低，觀察6 h后以10%氯化鉀2 ml靜脈注射處死。用肝素生理鹽水沖洗，沿心臟長(zhǎng)軸取約2 mm厚左心室心肌組織置10%中性甲醛固定、埋蠟、切片、HE染色。

將雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、冠脈微栓塞組、常規(guī)藥物組(阿司匹林20 mg/kg+阿托伐他汀4 mg/kg)及常規(guī)藥物+通心絡(luò)組：在常規(guī)藥物組基礎(chǔ)上+通心絡(luò)1.0 g/kg。給藥組均為術(shù)前3 h負(fù)荷量給藥，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為10只。

1.4.2 TNF-α，IL-1β及cTnI測(cè)定 ELASA法測(cè)定血漿TNF-α，IL-1β，敏感性<1 pg/ml；肌鈣蛋白Ⅰ檢測(cè)：將樣本吸入固相針內(nèi)，cTnI與固相針內(nèi)墻包被的鼠抗人cTnI單克隆抗體結(jié)合，標(biāo)記堿性磷酸酶的鼠抗人cTnI單克隆抗體吸入固相針內(nèi)，與待測(cè)定的cTnI結(jié)合；cTnI含量與扣除本底后的熒光值成正比，在450 nm處檢測(cè)其熒光值。儀器通過(guò)多點(diǎn)定標(biāo)曲線自動(dòng)計(jì)算樣本中cTnI濃度。

1.4.3 免疫組化 取石蠟包埋心臟標(biāo)本，沿左室長(zhǎng)軸行4 μm厚度連續(xù)切片，分別取5個(gè)切片；PBS洗3次，高壓修復(fù)抗原；3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min；正常山羊血清孵育10 min；一抗?jié)窈袃?nèi)孵育,37 ℃ 1.5 h，第二抗體孵育10 min；鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液孵育10 min；DAB顯色液；蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。

2 結(jié)果

2.1 通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞心肌損傷標(biāo)志物cTnI水平的影響 由表1可見(jiàn)術(shù)前各組血清cTnI水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；術(shù)后6 h除假手術(shù)組與術(shù)前比較沒(méi)有明顯差異外，其余各組均有明顯的升高(P<0.01)，提示采用月桂酸鈉制備兔冠狀動(dòng)脈微栓塞模型是成功的。術(shù)后6 h與微栓塞組比較，常規(guī)藥物組及常規(guī)藥物+通心絡(luò)組cTnI水平明顯降低(P<0.05)；與常規(guī)藥物組比較，常規(guī)藥物+通心絡(luò)組cTnI水平亦明顯降低(P<0.05)，提示通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞心肌損傷起保護(hù)作用。

表1 各組血清cTnI的變化

2.2 通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞兔心肌組織病理學(xué)的影響 由圖1可見(jiàn)，術(shù)后6 h假手術(shù)組(A)心肌細(xì)胞排列整齊，無(wú)間質(zhì)水腫，未見(jiàn)微梗死灶；微栓塞組(B)心肌內(nèi)可見(jiàn)明顯微梗死灶，間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；常規(guī)藥物組(C)心肌內(nèi)可見(jiàn)少量微梗死灶及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，程度較微栓塞組明顯減輕；常規(guī)藥物+通心絡(luò)組(D)心肌微梗死灶進(jìn)一步減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，結(jié)果亦提示通心絡(luò)保護(hù)冠脈微栓塞兔的心肌損傷。

A：假手術(shù)組；B：微栓塞組；C：常規(guī)藥物組；D：常規(guī)藥物+通心絡(luò)組

2.3 通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞兔血清炎癥因子TNF-α、IL-1β水平的影響 為了探討通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞兔心肌損傷保護(hù)作用機(jī)制，首先采用ELASA法檢測(cè)各組血清炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平。由表2可見(jiàn)術(shù)后6 h微栓塞組較假手術(shù)組血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.01)；與微栓塞組比較，常規(guī)藥物及常規(guī)藥物+通心絡(luò)組TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.01)；與常規(guī)藥物組比較，常規(guī)藥物+通心絡(luò)組TNF-α、IL-1β水平亦明顯降低(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果提示通心絡(luò)降低冠脈微栓塞兔血清炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平。

表2 通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞兔血清炎癥因子TNF-α、IL-1β水平的影響

2.4 通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞兔心肌組織TNF-α表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步探討通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞兔心肌損傷保護(hù)作用機(jī)制，觀察通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞兔心肌組織TNF-α表達(dá)的影響。假手術(shù)組心肌細(xì)胞僅表達(dá)少量TNF-α；微栓塞組在微梗死灶內(nèi)、非梗塞血管周邊的心肌及血管內(nèi)皮TNF-α均強(qiáng)表達(dá)；常規(guī)藥物組僅在微梗死灶內(nèi)可見(jiàn)TNF-α陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞；常規(guī)藥物+通心絡(luò)組心肌細(xì)胞TNF-α表達(dá)較常規(guī)藥物組明顯減少(圖2)。

箭頭示紅色顆粒細(xì)胞為TNF-α陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞A：假手術(shù)組；B：微栓塞組；C：常規(guī)藥物組；D：常規(guī)藥物+通心絡(luò)組

2.5 通心絡(luò)對(duì)冠脈微栓塞兔心肌組織IL-1β表達(dá)的影響 IL-1β在假手術(shù)組小血管內(nèi)及心肌細(xì)胞弱表達(dá)；微栓塞組IL-1β在小血管內(nèi)和微梗塞灶內(nèi)心肌細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)；常規(guī)藥物組在小血管內(nèi)可見(jiàn)IL-1β陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞；常規(guī)藥物+通心絡(luò)組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞較常規(guī)藥物組明顯減少(圖3)。棕紅色顆粒細(xì)胞為IL-1β陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

A：假手術(shù)組；B：微栓塞組；C：常規(guī)藥物組；D：常規(guī)藥物+通心絡(luò)組

3 討論

冠脈微栓塞(CME)是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)常見(jiàn)的不良事件，其發(fā)生機(jī)制可能有易損斑塊脫落、內(nèi)皮損傷、血小板激活等。冠脈微栓塞可引起炎癥反應(yīng)、心臟收縮功能不全、無(wú)復(fù)流或慢血流，導(dǎo)致心肌微梗死。因此，如何減少CME的發(fā)生及改善CME引起的心肌損傷具有重要的臨床意義。臨床上冠脈微栓塞的栓子可以由破潰的冠脈粥樣硬化斑塊、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等具有生物活性的物質(zhì)構(gòu)成，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射月桂酸鈉制作冠脈微栓塞模型，符合臨床冠脈微栓塞的改變。

通心絡(luò)運(yùn)用中醫(yī)絡(luò)病學(xué)說(shuō)研制而成，由人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲(chóng)等中草藥組成，可益氣活血、通絡(luò)止痛，具有抗栓、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善微循環(huán)及減輕心肌損傷等作用。

張海濤等[7]研究表明在心肌梗死再灌注前2 h給予大劑量通心絡(luò)，可顯著降低再灌注后細(xì)胞粘附和促炎癥因子如：血清P-選擇素、細(xì)胞間粘附分子-1、IL-6，調(diào)高抗炎癥因子如IL-10水平，抑制TNF-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成，減輕血管內(nèi)皮損傷和心肌組織炎癥浸潤(rùn)并縮小心肌無(wú)復(fù)流面積。Li Xiangdong等[8-9]報(bào)道單一低負(fù)荷量通心絡(luò)通過(guò)上調(diào)eNOS絲氨酸(1179)和絲氨酸(635)位點(diǎn)的磷酸化，介導(dǎo)蛋白激酶A通路，降低無(wú)復(fù)流及心肌缺血再灌注損傷，縮小梗死面積；同時(shí)進(jìn)一步闡明通心絡(luò)通過(guò)蛋白激酶A通路抑制心肌炎癥、細(xì)胞凋亡和水腫。陳章煒等[10]報(bào)道CME后血清TNF-α水平更早達(dá)到峰值，血清cTnT亦升高，但達(dá)峰偏晚，提示二者結(jié)合對(duì)早期發(fā)現(xiàn)和診斷CME起重要作用。Jia Yongliang等[11]研究表明通心絡(luò)在單藥或聯(lián)合應(yīng)用中療效均優(yōu)于消心痛。Zhang Huatian等[12]報(bào)道在ENLEAT試驗(yàn)中，急性心肌梗死急診PCI治療術(shù)后常規(guī)使用通心絡(luò)可降低無(wú)復(fù)流梗死心肌面積。

目前術(shù)前負(fù)荷量通心絡(luò)在CME中的作用如何？其機(jī)制亦尚未闡明。本研究采用心腔內(nèi)注射月桂酸鈉制備兔CME模型，結(jié)果表明CME組血清cTnI水平顯著升高，心肌內(nèi)可見(jiàn)明顯微梗死灶，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血清TNF-α、IL-1β水平顯著升高，微梗死灶內(nèi)及血管內(nèi)皮TNF-α與IL-1β均強(qiáng)表達(dá)；在常規(guī)藥物的基礎(chǔ)上負(fù)荷量通心絡(luò)顯著降低CME兔血清cTnI水平，縮小心肌微梗死灶，減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低血清炎癥因子TNF-α、IL-1β水平，降低心肌組織TNF-α與IL-1β的表達(dá)水平。Zhang Lei等[2]研究表明通過(guò)增加通心絡(luò)的劑量可增加易損斑塊穩(wěn)定性。本次研究首次報(bào)道術(shù)前負(fù)荷量通心絡(luò)給藥可能通過(guò)抑制促炎癥因子，減輕CME引起的心肌損傷，提示急性冠脈綜合征患者在PCI術(shù)前給予中藥通心絡(luò)可以減輕微栓塞引起的心肌損傷。

【參考文獻(xiàn)】

[1] MORISHMA I,SONE T,OKMUM K,etal.Angiographic no-reflow phenomenon as a predictor of adverse long term outcome in patients treated with percutaneous transluminal coronary angioplasty for first acute myocardial infarction[J].Am Coll Cardial,2000,36:1202-1209.

[2] ZHANG LEI,LIU YAN,LU XAIOTING,etal.Traditional Chinese medication Tongxinluo dose-dependently enhances stability of vulnerable plaques:a comparison with a high-dose simvastatin therapy[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,297:H2004-H2014.

[3] BAI WEIWEI,XING YONGFANG,WANG BIN,etal.Tongxinluo Improves Cardiac Function and Ameliorates Ventricular Remodeling in Mice Model of Myocardial Infarction through Enhancing Angiogenesis[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:813247.

[4] CHEN ZHANGQIANG,HONG LANG,WANG HONG.The effects of tongxinluo capsule on platelet activities and vascular endothelial functions as well as prognosis in patients with acute coronary syndrome undergoing percutaneous coronary intervention[J].Heart,2011,97:A153-A154.

[5] 綦海,張毛毛,吳健，等.月桂酸鈉致心肌微循環(huán)栓塞機(jī)制的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志,2011,3(6):55-59.

[6] 陸永光,李浪.急性冠狀動(dòng)脈微栓塞動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2010,31(3):452-453.

[7] 張海濤,楊躍進(jìn),程宇彤,等.通心絡(luò)預(yù)給藥2 h對(duì)豬急性心肌梗死再灌注后心肌無(wú)再流和細(xì)胞因子變化的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,29(9):821-824.

[8] LI XIANGDONG,YANG YUEJIN,GENG YONGJIAN,etal.Tongxinluo reduces myocardial ischemia-reperfusion injury and no-reflow by stimulating the phosphorylation of eNOS via the PKA pathway[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,299(4):H1255-1261.

[9] LI XIANGDONG,YANG YUEJIN,CHENG YETING,etal.Protein kinase A-mediated cardioprotection of Tongxinluo relates to the inhibition of myocardial inflammation,apoptosis,and edema in reperfused swine hearts[J].Chin Med J (Engl),2013,126(8):1469-1479.

[10] 陳章煒,錢菊英,馬劍英，等.輕度冠狀動(dòng)脈微栓塞后TNF-α和cTnT的變化[J].中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志,2010,10(5):310-313.

[11] JIA YONGLINAG,BAO FEIFEI,HUANG FANGYI,etal.Is tongxinluo more effective than isosorbide dinitrate in treating angina pectoris?A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].J Altern Complement Med,2011,17(12):1109-1117.

[12] ZHANG HUATIAN,JIA ZENGHE,ZHANG JIE,etal.No-reflow protection and long-term efficacy for acute myocardial infarction with Tongxinluo:a randomized double-blind placebo-controlled multicenter clinical trial (ENLEAT Trial)[J].Chin Med J (Engl),2010,123(20):2858-2864.