寇紅巖,冼健安,郭 慧,錢 坤,苗玉濤,葉超霞,潘訓(xùn)彬,王安利

(華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510631)

1 水體亞硝酸鹽的來(lái)源

亞硝酸鹽是水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中最常見的污染物之一。蝦類主要以氨的形式進(jìn)行氮廢物的排泄,亞硝酸鹽是由氨轉(zhuǎn)變而來(lái)的,這過(guò)程由亞硝化細(xì)菌所完成。硝化細(xì)菌可進(jìn)一步將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁},可見亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中脫氮作用的中間產(chǎn)物,但由于硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)速度較亞硝化細(xì)菌慢很多,這一轉(zhuǎn)變過(guò)程容易失衡,亞硝酸鹽就被積累在養(yǎng)殖水體中[1]。因此隨著養(yǎng)殖周期的延長(zhǎng),亞硝酸鹽的濃度也會(huì)越來(lái)越高。在高密度對(duì)蝦養(yǎng)殖池中,亞硝酸氮的質(zhì)量濃度可達(dá)到20 mg/L[2]。

2 亞硝酸氮對(duì)蝦類的半致死濃度

2.1 亞硝酸氮對(duì)不同蝦種的半致死濃度

多種蝦類的亞硝酸氮對(duì)不同蝦種的半致死濃度(median lethal concentration,LC50)已有研究報(bào)道,結(jié)果見表1。對(duì)于同種蝦類,不同學(xué)者的研究結(jié)果有一定的差異,可能是由于影響亞硝酸氮毒性的因素較多,不同研究條件有一定的差異所致。但總體上看,海水蝦類比淡水蝦類的亞硝酸氮耐受能力要高得多,主要與水體的鹽度有關(guān)。

2.2 亞硝酸氮對(duì)不同蝦齡的半致死濃度

斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[3]和長(zhǎng)毛對(duì)蝦(P.penicillatus)[4]的研究結(jié)果顯示,各時(shí)期幼蟲的亞硝酸鹽耐受能力依次為: 仔蝦>糠蝦>溞狀幼蟲>無(wú)節(jié)幼蟲。在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的研究中,仔蝦的 24h耐受力不如糠蝦和溞狀幼體,但仔蝦的96 h耐受力則遠(yuǎn)高于糠蝦和溞狀幼體[5]。對(duì)于日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus),溞狀幼體的 24 h耐受力高于糠蝦和仔蝦,但96h時(shí)仔蝦的耐受力最高[5]。刀額新對(duì)蝦(Metapenaeus ensis)則表現(xiàn)為: 仔蝦>糠蝦>無(wú)節(jié)幼蟲>溞狀幼蟲[6]。對(duì)于不同蝦齡的成體,目前仍缺乏系統(tǒng)的比較研究,而不同學(xué)者研究的條件也存在一定的差異,較難進(jìn)行準(zhǔn)確的比較。

2.3 影響亞硝酸鹽毒性的環(huán)境因素

目前研究結(jié)果顯示,影響亞硝酸鹽毒性的環(huán)境因素主要有鹽度、Cl-含量、溶氧和 pH等。鹽度對(duì)亞硝酸鹽毒性的影響十分顯著,鹽度越高,蝦類對(duì)亞硝酸鹽的耐受能力就越強(qiáng)[7-9]。鹽度影響其毒性可能主要與 Cl-含量有關(guān),主要與 Cl-競(jìng)爭(zhēng)鰓上的吸收位點(diǎn),鹽度越高,Cl-的含量就越高,競(jìng)爭(zhēng)吸收進(jìn)入體內(nèi)的就越少。研究證實(shí)水環(huán)境中Cl-含量越高,蝦類對(duì)亞硝酸鹽的耐受能力也越強(qiáng)[10-12]。研究表明水體溶氧量越高,亞硝酸鹽的毒性越低[13-14]。破壞蝦類血藍(lán)蛋白的正常攜氧能力,導(dǎo)致機(jī)體缺氧是亞硝酸鹽的毒性機(jī)制之一[15-18],因此水體溶氧量的提高可緩解亞硝酸鹽的毒性作用。在水環(huán)境中,亞硝酸鹽以亞硝酸根離子()和亞硝酸(HNO2)兩種形式存在,后者能自由擴(kuò)散通過(guò)鰓進(jìn)入機(jī)體,毒性較大。在天然水體pH條件下,只有很少一部分亞硝酸鹽以HNO2的形式存在,當(dāng)水體pH下降時(shí),以HNO2形式存在的亞硝酸鹽的比例上升,因此在低pH條件下,亞硝酸鹽的毒性較強(qiáng)。在pH為6.8、8.2和9.8的水體中,斑節(jié)對(duì)蝦經(jīng)0.72 mmol/L亞硝酸鹽脅迫48 h后,血淋巴的亞硝酸鹽濃度分別上升至3.70、2.87和1.91 μmol/L[19]。溫度也是十分重要的環(huán)境因子,但目前仍未見關(guān)于溫度影響亞硝酸鹽對(duì)蝦類的毒性的研究報(bào)道。

在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中,亞硝酸鹽并不是單一存在的,氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮可相互轉(zhuǎn)化,各組分的比例會(huì)受到環(huán)境因子(溶氧、pH、鹽度等)的影響,主要是由于這些環(huán)境因子改變了硝化或反硝化的方向和速率[20-22]。另外,養(yǎng)殖模式也會(huì)影響總氮和亞硝酸氮的含量[23]。因此,在池塘養(yǎng)殖中,亞硝酸鹽毒性的影響因素和過(guò)程要復(fù)雜得多。

表1 亞硝酸氮對(duì)不同蝦類的半致死濃度(LC50,mg/L)

續(xù)表

3 亞硝酸鹽的吸收和積累

圖1 亞硝酸鹽對(duì)蝦類血淋巴的影響

亞硝酸鹽進(jìn)入血淋巴后,被運(yùn)送到其他組織,并有不同程度的積累。斑節(jié)對(duì)蝦暴露于0.36 mmol/L的-N中48h后,肌肉、肝胰腺、鰓、前腸、血淋巴、心臟、眼柄和中腸的-N濃度分別上升至外環(huán)境濃度的 1.1、3.4、5.0、5.6、6.6、6.8、8.5和11.4倍,此研究結(jié)果顯示肌肉基本不積累-N,而中腸積累的-N最多[42]。海水魚類除通過(guò)鰓吸收亞硝酸鹽外,還可以通過(guò)腸道進(jìn)行吸收[1],斑節(jié)對(duì)蝦的中腸是積累-N最多的組織,可能意味著海水蝦類也有著相同的吸收機(jī)制,即在吞飲水的同時(shí)可能通過(guò)中腸吸收亞硝酸鹽。

4 亞硝酸鹽對(duì)蝦類的毒性影響

4.1 對(duì)蝦類生長(zhǎng)和變態(tài)的影響

一定濃度的亞硝酸鹽會(huì)抑制蝦類的生長(zhǎng)和變態(tài)發(fā)育。凡納濱對(duì)蝦置于(2.5～5.0)mg/L-N中養(yǎng)殖14 d,其體長(zhǎng)、體質(zhì)量增長(zhǎng)率和存活率均低于對(duì)照組[25]。羅氏沼蝦幼體經(jīng)-N亞急性毒性作用,出現(xiàn)發(fā)育變態(tài)緩慢,增質(zhì)量率和存活率下降等現(xiàn)象[33,43]。因此,控制水體中亞硝酸鹽濃度對(duì)蝦類健康苗種的培育至關(guān)重要的一環(huán)[44-45]。

4.2 對(duì)蝦類組織結(jié)構(gòu)的影響

血淋巴是蝦體積累亞硝酸鹽的主要部位之一,如前所示,血漿中的-N濃度可以累積達(dá)到外環(huán)境的6.6倍,因此在亞硝酸鹽脅迫過(guò)程中,血細(xì)胞將遭受胞外高濃度-N的刺激。羅氏沼蝦經(jīng)-N應(yīng)激后,血細(xì)胞總數(shù)(Total haemocyte count,THC)不斷下降,血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示透明細(xì)胞出現(xiàn)核變小,常染色質(zhì)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和線粒體數(shù)量減少等現(xiàn)象,而半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞除出現(xiàn)上述現(xiàn)象外,細(xì)胞質(zhì)中的高電子致密顆粒數(shù)量也減少[46],這些結(jié)果表明-N導(dǎo)致了血細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常,這將進(jìn)一步導(dǎo)致各種生理和免疫功能的異常。

4.3 對(duì)蝦類血藍(lán)蛋白及其載氧能力的影響

亞硝酸鹽對(duì)血藍(lán)蛋白載氧能力的破壞被認(rèn)為是其對(duì)蝦類產(chǎn)生毒性的主要機(jī)制之一。眾多研究顯示,蝦類受到亞硝酸鹽脅迫后,隨著血淋巴亞硝酸鹽濃度的上升,氧合血藍(lán)蛋白和血清總蛋白含量、氧合血藍(lán)蛋白占血清總蛋白含量的比例、血淋巴的氧親和力均顯著下降[15-18]。血藍(lán)蛋白是甲殼動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的載氧蛋白,亞硝酸鹽進(jìn)入血淋巴后,導(dǎo)致氧合血藍(lán)蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跹{(lán)蛋白,并抑制脫氧血藍(lán)蛋白與氧結(jié)合[15];另一方面,與亞硝酸鹽破壞血紅蛋白的機(jī)制類似,亞硝酸鹽可能進(jìn)一步導(dǎo)致脫氧血藍(lán)蛋白氧化為變性血藍(lán)蛋白,研究發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽與脫氧血藍(lán)蛋白的反應(yīng)速率比其與氧合血藍(lán)蛋白的反應(yīng)速率快15倍[49]。因此,亞硝酸鹽導(dǎo)致血淋巴的氧親和力下降,破壞了其正常的攜氧能力,最終導(dǎo)致蝦類窒息死亡[15](圖1)。

4.4 對(duì)蝦類血淋巴生化組成和生理狀態(tài)的影響

4.4.1 離子含量

正常狀態(tài)下,鰓細(xì)胞中 Cl-的流入和的排出調(diào)節(jié)了Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)和血淋巴的酸堿平衡。亞硝酸鹽脅迫下,在 Cl-/交換過(guò)程中,由于的競(jìng)爭(zhēng),部分Cl-被替代,進(jìn)入蝦體的Cl-減少。小龍蝦暴露于1 mmol/L亞硝酸鹽1周后,血淋巴的Cl-含量下降了40%[41]。日本對(duì)蝦暴露于0.36 mmol/L亞硝酸鹽24 h后,血淋巴Cl-減少了58 mmol/L[50]。亞硝酸鹽脅迫下,血淋巴中的也會(huì)下降[51],一方面可能由于與進(jìn)行交換而排出體外,另一方面有研究者認(rèn)為與氨通過(guò)鳥氨酸循環(huán)合成了尿素[52](圖1)。

日本囊對(duì)蝦的研究顯示,亞硝酸鹽脅迫對(duì)血淋巴中 K+、Ca2+和 Mg2+的含量沒(méi)有顯著影響,而 Na+含量則顯著下降,作者認(rèn)為 Na+含量的下降可能是蝦體水分含量上升所致[50]。小龍蝦的研究也發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽脅迫導(dǎo)致血淋巴 Na+含量下降,另外還發(fā)現(xiàn)其肌肉的 K+含量大大下降,而在中腸腺則有升高的趨勢(shì),肌肉流失的部分 K+可能轉(zhuǎn)移到了中腸腺內(nèi)[53]。羅氏沼蝦在低Cl-含量的水體中受到亞硝酸鹽脅迫時(shí),血淋巴的Na+、K+和Mg2+的含量均有顯著下降[10]。

4.4.2 蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量

蝦類血淋巴中含有大量的蛋白質(zhì),其中80%～95%為血藍(lán)蛋白[15],剩下的部分主要是與免疫和凝集相關(guān)的因子,如酚氧化酶、凝集素、β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白和抗菌肽等。血清總蛋白含量在亞硝酸鹽脅迫下呈現(xiàn)顯著的下降[15,17,50],其下降一方面可能由于部分蛋白質(zhì)被加速代謝為氨氮;另一方面,在亞硝酸鹽脅迫下,血清中多種免疫酶類的活性下降[27],血細(xì)胞產(chǎn)生各類功能蛋白的能力可能受到了抑制。與總蛋白含量的變化相同,血清游離氨基酸含量也呈現(xiàn)下降現(xiàn)象,另外還伴隨著氨氮排泄量的顯著上升[50](圖 1),表明其下降可能是代謝速度加快所致。

4.4.3 氮代謝

在亞硝酸鹽脅迫下,蝦類的總氮、氨氮、尿素氮和有機(jī)氮的排泄量均顯著提高[52,54]。日本對(duì)蝦經(jīng)0.076和1.433 mmol/L亞硝酸鹽脅迫48 h后,其氨氮的排泄量分別是對(duì)照組對(duì)蝦的1.7和2.9倍,尿素氮的排泄量分別是對(duì)照組對(duì)蝦的263和694倍,有機(jī)氮的排泄量分別是對(duì)照組對(duì)蝦的49和832倍[52]。這些結(jié)果表明,亞硝酸鹽脅迫導(dǎo)致蝦體的生理代謝過(guò)程加快。

研究表明,在十足目甲殼動(dòng)物的氮排泄物中,氨氮占 60%～70%,氨基酸占 10%,另外還有少量的尿素、尿酸和氧化三甲胺[55]。亞硝酸脅迫下,氮代謝途徑也發(fā)生了改變。日本對(duì)蝦在正常生理狀態(tài)下,氨氮和尿素氮分別占排泄總氮的 41.7%～90.8%和2.8%～10.5%;暴露于0.076和1.433 mmol/L亞硝酸鹽 24 h后,氨氮占排泄總氮的比例分別下降至10.0%和3.8%,其尿素氮的比例分別上升至58.7%和21.4%,而有機(jī)氮的比例則分別上升至 31.3%和74.8%[52]。

尿素可來(lái)源于3種途徑: (1)鳥氨酸循環(huán);(2)尿酸分解;(3)精氨酸水解[52]。日本對(duì)蝦經(jīng)亞硝酸鹽脅迫后,血淋巴中的氨氮、和精氨酸含量均下降,而尿素含量上升[52]。日本沼蝦經(jīng)1.39 mmol/L亞硝酸鹽暴露 24 h后,肝胰腺和血淋巴中的精氨酸酶活性顯著升高[54],這些結(jié)果表明尿素含量的升高可能來(lái)源于鳥氨酸循環(huán)(氨與的合成)或者精氨酸水解[50,52,54]。尿素合成的加強(qiáng)一方面可能為了降低血氨的含量,從而降低血氨與外界攝入的亞硝酸鹽的聯(lián)合毒性[54];另一方面尿素可能起著調(diào)節(jié)滲透壓的作用[50,56](圖 1)。

4.4.4 滲透壓和pH

蝦血清滲透壓隨著亞硝酸鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸下降的現(xiàn)象,且脅迫濃度越大,下降速度越快。日本囊對(duì)蝦經(jīng)0.72 mmol/L亞硝酸鹽脅迫48 h后,滲透壓下降至 884.5 mOsm/kg,為對(duì)照組的96.8%[50]。如前所述,在亞硝酸鹽的作用下,蝦血淋巴中的 Cl-、Na+、蛋白質(zhì)和游離氨基酸等含量均下降,是導(dǎo)致血清滲透壓下降的主要原因;另外,蝦體水分含量的升高也是造成滲透壓下降的原因之一[50](圖1)。多種蝦類的研究均發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽會(huì)導(dǎo)致血淋巴pH下降[10,16,51,57],含量的下降可能主要原因之一。

4.5 對(duì)蝦類免疫功能的影響

凡納濱對(duì)蝦置于含有亞硝酸氮 4.0和 8.0 mg/L的水體中養(yǎng)殖 18 d后,其 THC、超氧化物歧化酶(SOD)活力、PO活力、抗菌活力、溶菌活力和血清蛋白含量均顯著下降,亞硝酸氮濃度越高,對(duì)蝦的免疫功能越低[27]。紅螯螯蝦置于(0.3～6.0)mg/L亞硝酸鹽下飼養(yǎng)2周后,螯蝦肝胰腺、鰓和肌肉中的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性均顯著下降,鰓組織 Na+,K+-ATPase和Ca2+,Mg2+-ATPase的活性也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)[48]。將凡納濱對(duì)蝦暴露于5.15,11.06和21.40 mg/L的亞硝酸氮中 48～168 h,會(huì)導(dǎo)致弧菌(Vibrio alginolyticus)注射后的對(duì)蝦的死亡率上升;對(duì)蝦暴露于4.94,9.87 和19.99 mg/L的亞硝酸氮中,其THC和PO顯著下降。在馬氏沼蝦[36]和羅氏沼蝦[58]的研究中也得到類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明亞硝酸鹽脅迫抑制了對(duì)蝦的免疫功能,增加了其對(duì)病原體的易感性。

凡納濱對(duì)蝦在9.87 和19.99 mg/L的亞硝酸氮暴露96 h后,血細(xì)胞的超氧陰離子()含量顯著上升,這些升高的可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化毒性[2]。日本沼蝦暴露于亞致死濃度的亞硝酸氮水體中24 h后,活性氧(ROS)含量增加 97%,而 SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)和GPx活力則分別下降了67%、80.6%和82.7%。ROS含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致機(jī)體受到氧化損傷[59],亞硝酸鹽脅迫使 ROS的產(chǎn)生和清除失衡,從而導(dǎo)致組織受到氧化損傷可能是其毒性機(jī)制之一[35]。這一氧化毒性機(jī)制在斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞的研究中得到了證實(shí),將斑節(jié)對(duì)蝦置于 20 mg/L的亞硝酸氮水體中應(yīng)激 48 h后,其THC顯著下降,同時(shí)ROS含量顯著提高,DNA損傷細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的比例均顯著上升,表明亞硝酸鹽誘導(dǎo)了血細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS,這些ROS對(duì)血細(xì)胞造成了氧化傷害并進(jìn)一步誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致了THC的下降,而THC下降到一定的閥值將會(huì)導(dǎo)致蝦的死亡[60](圖1)。

5 展望

上述研究結(jié)果顯示,蝦類的存活、生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝和免疫功能等均會(huì)受到水體亞硝酸鹽的毒性影響。但是,這些研究仍不夠深入,其毒性影響的作用機(jī)制仍不明確。今后可從以下幾個(gè)方面開展進(jìn)一步的研究:

(1)溫度是近年來(lái)十分受關(guān)注的環(huán)境因子,研究溫度對(duì)亞硝酸鹽毒性的影響及其機(jī)制對(duì)蝦類的健康養(yǎng)殖有著重要指導(dǎo)意義;(2)近年來(lái)的研究認(rèn)為蝦類存在類免疫球蛋白[61],可進(jìn)一步開展亞硝酸鹽對(duì)這些類免疫球蛋白影響的研究;(3)利用最新的組學(xué)技術(shù),研究亞硝酸鹽對(duì)蝦類毒性影響的分子機(jī)制。

這些研究也表明,亞硝酸鹽是蝦類健康養(yǎng)殖過(guò)程中不可忽視的環(huán)境因子,必須進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)控。但是,亞硝酸鹽的控制是多方面的,其中健康合理的營(yíng)養(yǎng)投喂是控制亞硝酸鹽的重要因素之一。營(yíng)養(yǎng)搭配合理的配合飼料不但可以減少蝦類氮廢物的排放,而且可以提高蝦類的免疫功能和抗脅迫能力。但目前針對(duì)蝦類抗亞硝酸鹽脅迫能力的研究仍甚少[62,63],未來(lái)的研究可更加關(guān)注營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和各類添加劑[64]在蝦類抗亞硝酸鹽脅迫能力方面的作用。另外,通過(guò)現(xiàn)代遺傳育種手段選育抗性強(qiáng)的品系也是提高養(yǎng)殖蝦類抗亞硝酸鹽脅迫能力的重要途徑之一[65]。

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