鄒 琰,李 莉,張 良,呂 芳,辛美麗,張少春,邱兆星,劉洪軍

(1.山東省海水養(yǎng)殖研究所 山東省海水健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,山東 青島 266002;2.國家海洋局 第一海洋研究所,山東 青島 266061)

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)隸屬于軟體動物門(Mollusca),瓣鰓綱(Lamellibranchia),簾形目(Veneroida),蛤仔屬(Ruditapes)。是廣溫、廣鹽、廣分布的亞熱帶種,是蛤仔屬中我國僅有的兩個種類之一[1]。我國是世界菲律賓蛤仔的第一養(yǎng)殖大國,山東省是我國菲律賓蛤仔主產(chǎn)地。近年來,隨著菲律賓蛤仔人工養(yǎng)殖規(guī)模的急速發(fā)展,異地移養(yǎng)現(xiàn)象頻繁出現(xiàn),加速了菲律賓蛤仔自然群體間遺傳背景的的混雜,對我國菲律賓蛤仔種質(zhì)資源的保護產(chǎn)生了不利的影響。因此,深入研究菲律賓蛤仔群體遺傳學,對保護菲律賓蛤仔種質(zhì)資源及其增養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展有著重要的意義。

國內(nèi)已有學者利用形態(tài)參數(shù)[2]、同工酶[3-5]、RAPD標記[6]、AFLP標記[7]對不同地理群體的菲律賓蛤仔進行了遺傳學研究,但山東菲律賓蛤仔主要產(chǎn)區(qū)的蛤仔遺傳基礎背景依然模糊。作者對山東菲律賓蛤仔 4個主要產(chǎn)區(qū)的自然群體進行遺傳多樣性AFLP分析,探討各群體的主要遺傳參數(shù)和遺傳變異水平,為了解菲律賓蛤仔的種質(zhì)狀況提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)樣品為 2009年 10月采自煙臺牟平(Muping,簡稱:MP)、威海乳山(Rushan,簡稱: RS)、青島即墨(Jimo,簡稱: JM)和濱州無棣(Wudi,簡稱: WD)自然海區(qū)的野生個體,經(jīng)活體運輸至實驗室進行形態(tài)性狀測量與解剖。各樣品采樣地點、采集時間及樣品數(shù)量詳細信息列于表1。取樣品的閉殼肌放入離心管中,保存在-76℃的超低溫冰箱中,用于DNA提取。

實驗用的EcoR I、Mse I內(nèi)切酶和T4-DNA連接酶買自Fermentas公司,PCR擴增體系使用的Taq酶、Buffer、MgCl2、dNTP購自青島碧海生物技術(shù)有限公司。

表1 菲律賓蛤仔實驗樣品來源Tab.1 The sources of experimental samples of Ruditapes philippenarum

1.2 DNA提取和AFLP分析

采用 Li等[8]的方法進行樣品 DNA提取。DNA樣品采用 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測,經(jīng)紫外分光光度儀(VarianCary 50型)進行定量,調(diào)整DNA質(zhì)量濃度為100 mg/L,置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

遺傳多樣性檢測使用的六對 AFLP選擴引物如下: E-ATG/M-CCT,E-ACA/M-CCT,E-AAG/M-CGA,E-ACA/M-CGA,E-ACT/M-CCT,E-ACT/M-CGA,主要參照Vos等[9]的方法進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)菲律賓蛤仔各群體基因組DNA電泳條帶的有、無分別記錄為“1”、“0”,得到數(shù)據(jù)矩陣,找出 4個地理群體的特異性擴增位點,并計算出現(xiàn)頻率。

采用AFLPSURV 1.0軟件計算多態(tài)位點比率(P)和期望雜合度(He)[10]。群體間遺傳距離參照Nei[11],用軟件TFPGA軟件進行計算[12],并使用TFPGA軟件的非加權(quán)平均聚類法對菲律賓蛤仔的 4個地理群體進行聚類分析,繪制聚類圖。群體間 Fst值的顯著性檢驗采用TFPGA軟件的Exact Test進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴增結(jié)果

在 100～330bp 范圍內(nèi),用 6對擴增引物在菲律賓蛤仔4個野生地理群體共200個個體中統(tǒng)計了356個位點,平均每對引物擴增 59.3條產(chǎn)物。其中E-ACA/M-CGA得到56個,E-AAG/M-CGA得到61個,E-ATG/M-CCT得到82個,E-ACT/M-CCT得到54個,E-ACT/M-CGA得到40個,E-ACA/M-CCT得到63個。從表2可得知,乳山群體的擴增位點最多,無棣群體的擴增位點數(shù)最少。4個菲律賓蛤仔地理群體的多態(tài)位點比率為 70.5%～74.7%,期望雜合度為0.250～0.259。其中即墨群體的期望雜合度值最大,為0.259;無棣群體的期望雜合度值最小,為 0.250,見表 3。

表2 菲律賓蛤仔群體AFLP標記擴增結(jié)果Tab.2 The amplification results of Ruditapes philippinarum populations

表3 菲律賓蛤仔群體AFLP多態(tài)性位點比率和期望雜合度Tab.3 The expected heterozygosity (He)and percentage of polymorphism loci (P)of four Ruditapes Philippinarum populations

2.2 遺傳分化分析

4個菲律賓蛤仔野生地理群體間的遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.063 5～0.102 9,平均大小為0.088 8。乳山與無棣兩個群體之間的遺傳分化系數(shù)最小,為0.063 5,即墨與無棣群體之間的遺傳分化系數(shù)最高(表4)。對4個群體兩兩P 值的Exact Test結(jié)果顯示,4個群體的遺傳分化系數(shù)兩兩顯著。

表4 菲律賓蛤仔群體間遺傳分化分析Tab.4 Pairwise genetic differentiation between four populations of Ruditapes philippinarum

2.3 聚類分析

由表 5可知,乳山群體與無棣群體的遺傳距離最近(0.026 3),而即墨群體和無棣群體之間的遺傳距離最大(0.044 8),變化趨勢與Fst值一致。

對菲律賓蛤仔4個地理群體進行聚類分析(圖1)。

表5 菲律賓蛤仔4個群體間遺傳距離Tab.5 Nei's unbiased genetic distance between four populations of Ruditapes philippinarum

圖1 菲律賓蛤仔群體的UPGMA聚類圖Fig.1 The dendrogram of four Ruditapes philippinarum populations by UPGMA cluster analysis

結(jié)果顯示乳山群體與無棣群體親緣關(guān)系最近,兩個群體首先聚在一起,獲得99%支持率。牟平群體和即墨群體的遺傳距離次之,兩者聚為一類,置信度獲得51%支持率。

3 討論

3.1 AFLP標記技術(shù)的檢測效果評價

本研究對山東沿海菲律賓蛤仔 4個野生地理群體進行遺傳多樣性AFLP分析。結(jié)果表明,4個群體的平均多態(tài)位點比率為 73.10%,對比文蛤野生群體的平均多態(tài)位點比率72.76%[13]和蝦夷扇貝野生群體的平均多態(tài)位點比率 66.29%[14],可知山東省菲律賓蛤仔的遺傳多樣性相對較高。

葛京盈等[4]對錦州、大連、丹東和青島4個地方的野生菲律賓蛤仔群體的同工酶進行了檢測,結(jié)果表明4個群體的多態(tài)位點百分數(shù)為33.33,平均雜合度期望值為 0.082 5;李旭光等[5]采用同工酶技術(shù)對福建平潭島、浙江象山港、江蘇海州灣和遼寧遼東灣 4個海區(qū)菲律賓蛤仔野生群體的生化遺傳特征進行了分析,結(jié)果表明 4個群體的平均多態(tài)位點比率為68.75%,平均雜合度期望值為0.306 1。由此可見與同工酶標記相比,在菲律賓蛤仔的檢測中,AFLP位點具有更豐富的多態(tài)性。

3.2 菲律賓蛤仔群體的遺傳多樣性分析

菲律賓蛤仔分布較廣,其分布海域間的生態(tài)環(huán)境的客觀差異,必然在各地理群體之間形成相對的地理隔離,進而造成某些差異。本研究中兩兩比較4個地理群體間的Fst值均顯示差異顯著,說明4個群體間存在顯著遺傳分化。各群體間的Fst值為0.063 5～0.102 9,其中無棣群體與乳山群體之間的遺傳分化系數(shù)最小,即墨群體和牟平群體的遺傳分化系數(shù)最高。Wright[15]認為 Fst值為 0～0.05,群體間無顯著分化;Fst值為0.05～0.15,群體間的分化程度中等。本研究的4個地理群體間Fst值均大于0.05,顯示了較高的分化程度。

4 結(jié)論

本文的研究結(jié)果表明,4個菲律賓蛤仔野生群體間已出現(xiàn)一定的遺傳分化。其中無棣群體和乳山群體的遺傳距離最近,即墨群體與無棣群體遺傳距離最遠。UPGMA樹結(jié)果也顯示無棣群體與乳山群體遺傳距離最近,而即墨群體與牟平群體則另聚在一起。4個野生群體并沒有遵循地理距離越近,遺傳結(jié)構(gòu)越為相似的規(guī)律,這可能與近年來菲律賓蛤仔異地移養(yǎng)所導致的種質(zhì)混雜、遺傳漸滲有關(guān)。

隨著菲律賓蛤仔人工養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,累代人工繁育導致的種質(zhì)問題越來越嚴重,菲律賓蛤仔異地移養(yǎng)現(xiàn)象也隨之廣泛出現(xiàn)。異地異養(yǎng)雖然可以在短時間內(nèi)提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益,但其底播增殖行為也在一定程度上造成了不同地區(qū)菲律賓蛤仔野生品種的交叉污染。山東是菲律賓蛤仔養(yǎng)殖大省,同樣存在這樣的問題。近些年,福建菲律賓蛤仔苗種因為價格便宜,沖擊了山東的菲律賓蛤仔苗種市場,許多育苗場大量采購福建蛤仔苗種,進行人工養(yǎng)殖、底播增殖,必然對當?shù)氐姆坡少e蛤仔的遺傳基礎產(chǎn)生影響。Liu等[7]對我國大連、青島、杭州和廈門 4個菲律賓蛤仔自然群體遺傳多樣性進行的 AFLP分析結(jié)果表明,青島群體與福建廈門群體遺傳相似程度較高,進而得出異地購苗增養(yǎng)殖已經(jīng)對青島菲律賓蛤仔野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響的結(jié)論。本研究中青島即墨群體與煙臺牟平群體遺傳距離較近,表明牟平菲律賓蛤仔野生群體可能也受到了福建菲律賓蛤仔遺傳雜交的污染。

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