紀利芹,蔣克勇,韓龍江,袁坤山,邱楚雯, 王寶杰,劉 梅,王 雷,溫海深

(1.中國海洋大學 水產(chǎn)學院,山東 青島 266003;2.中國科學院 海洋研究所 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術國家地方聯(lián)合工程實驗室,山東 青島 266071;3.青島科技大學 化學與分子工程學院,山東 青島 266061)

魚類是變溫動物,水溫的變化必然會改變其新陳代謝,進而影響其生長、發(fā)育,并使之產(chǎn)生相應的生理變化甚至病理反應,水溫也是影響魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)中的關鍵因素之一[1-3]。

大菱鲆(Scophthalmus maximus),屬于鰈形目(Pleuronectiformes),鲆科(Bothidae),原主要產(chǎn)自于大西洋東側沿岸,是較名貴的冷水性經(jīng)濟魚類。自1992年被引進中國后,因其生長較快、耐低溫、繁殖較快兼有膠質(zhì)豐富、風味獨特、市場價格高等優(yōu)良特性,現(xiàn)已成為中國北方地區(qū)為數(shù)不多的養(yǎng)殖較為廣泛的重要經(jīng)濟魚類之一。目前,大菱鲆的養(yǎng)殖區(qū)域分布在以山東半島、遼東半島以及天津為主的北方沿海地區(qū)[4-7],隨著大菱鲆養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,市場影響力的提高,南方及內(nèi)地市場越來越得到養(yǎng)殖戶和商家的關注,所以如何保證其在長途運輸過程中的品質(zhì)成為急需解決的技術難題。

目前,生態(tài)冰溫保活運輸技術已成為魚類?；钸\輸研究的新方向,即利用魚的生態(tài)冰溫,采用控溫方式,使其處于半休眠或完全休眠狀態(tài),從而降低新陳代謝,減少機械損傷,有效延長存活時間,達到長距離、大批量?；钸\輸?shù)哪康?。而且該方法無需用水,節(jié)能環(huán)保,并且水產(chǎn)品品質(zhì)能夠得到更好的保持,應用前景廣闊[8-9]。

血液是動物體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中的重要組織,具有運輸營養(yǎng)和代謝廢物、機體免疫等功能[10]。由Selye[11]的應激理論可知,在低溫脅迫下,魚體內(nèi)生理變化一定會在血液指標中體現(xiàn),因此血液指標能靈敏地反應魚體的生理、病理變化,可作為動物的營養(yǎng)水平、健康狀況及外界環(huán)境變化的生物指標[10,12-16]。魚類以糖原、脂肪和蛋白質(zhì)作為主要貯能物質(zhì),外界環(huán)境變化時,魚體最先分解糖原提供能量,且主要以分解肝糖原為主。氧氣不足時肌肉通過糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸,因此肝糖原和肌肉中乳酸值的變化能從側面反映體內(nèi)的能量變化。作者初步研究了連續(xù)降溫對大菱鲆成魚肝臟、肌肉及血清代謝等指標的影響,試圖了解大菱鲆的冷應激耐受性,并為大菱鲆的無水?；罴夹g提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用大菱鲆購自山東青島市南山水產(chǎn)品批發(fā)市場,個體初始體質(zhì)量為(400±46)g,暫養(yǎng)于實驗室控溫循環(huán)水過濾系統(tǒng),暫養(yǎng)期間控制水溫為(18.0±1)℃,溶氧為6 mg/L以上,pH約為7～8,鹽度為31,暫養(yǎng)2 d后,選取規(guī)格一致的成魚30尾進行實驗。

1.2 實驗設計

通過設計的降溫循環(huán)水裝置實現(xiàn)逐漸變溫,大菱鲆的采樣溫度點分別為: 18℃、13℃、8℃、5℃、3℃和1℃,水溫降溫速率設置為: ≤5℃/h (10℃以上)、≤2℃/h (10～1℃)。實驗開始前取樣測定一次指標作為起始對照;降溫開始后,待溫度降到設定的溫度點處立刻進行取樣,每個溫度點處取樣6尾。

1.3 樣品采集

開始降溫后在 13℃、8℃、5℃、3℃和 1℃處立刻進行隨機取樣,每個溫度點處取6尾平行。取出后立刻放入質(zhì)量濃度為 200 mg/L的MS-222溶液中做快速深度麻醉,配置MS-222溶液所用水的溫度與取樣時的溫度一致,尾靜脈采血,用 1mL注射器于魚尾柄動脈采血5 mL以上,血液不加抗凝劑,在4℃冰箱靜置5 h后,用離心機4℃、12 000 r/min、離心20 min制備血清,血清移入–80℃保存。采血后解剖,取出肝臟、肌肉等組織用液氮速凍后置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清生化指標的分析

制備好的血清采用全自動生化分析儀測定部分生化指標(邁瑞 BS-180),測定項目包括: 總蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總膽紅素、尿素、總膽固醇、甘油三酯和血糖。

1.5 肝糖原、肌肉乳酸含量的測定

肝糖原、肌肉乳酸含量的測定分別使用南京建成生物工程研究所的肝糖原試劑盒(A043)和乳酸試劑盒(A019-2),其中肝臟與肌肉樣品按照試劑盒說明書進行制備、處理。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 Spss17.0統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析(ANOVA)和 Duncan氏多重范圍比較進行分析,P＜0.05表示有顯著差異,所有結果均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 連續(xù)降溫對魚體血清蛋白濃度的影響

由圖1可知,在連續(xù)降溫過程中,血清中總蛋白和白蛋白的濃度變化趨勢整體一致: 均隨溫度降低而升高,總蛋白在 8℃時濃度達到最高(52.33±9.61)g/L,溫度降到 1℃時,濃度下降到初始水平附近。13℃實驗組總蛋白濃度顯著低于3℃實驗組濃度(P＜0.05),其余各組之間無顯著差異(P＞0.05)。

血清白蛋白在3℃時濃度達到最高值為(30.67±5.32)g/L,1℃時濃度也下降到初始濃度附近,與總蛋白在1℃時濃度變化相似,且1℃時的白蛋白濃度顯著低于 3℃時的濃度(P＜0.05),其余各組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.2 連續(xù)降溫對魚體血糖和肝糖原的影響

由圖2A可知,大菱鲆血糖濃度隨溫度的降低呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢,在 13℃時降到最低水平(0.85±0.22)mmol/L,在 3℃時含量達到最高(1.85±0.14)mmol/L,當溫度降到 1℃時血糖含量又降到初始水平,且8℃、5℃、3℃實驗組濃度顯著高于其余實驗組(P＜0.05)。

圖1 連續(xù)降溫對大菱鲆血液總蛋白及白蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effects of continuous cooling on mass concentrations of serum total protein and serum albumin in Scophthalmus maximus

圖2 連續(xù)降溫對大菱鲆血液血糖濃度和肝糖原質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.2 Effects of continuous cooling on concentrations of serum glucose and contents of liver glycogen in Scophthalmus maximus

由圖2B可知,肝糖原含量與血糖濃度變化趨勢一致,隨溫度降低呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢,在 8℃時濃度最高為(11.92±1.84)mg/g,最后當溫度降到1℃時回到初始水平,且 8℃、5℃、3℃實驗組濃度顯著高于其余實驗組(P＜0.05)。

2.3 連續(xù)降溫對魚體脂類的影響

由圖3A可知,大菱鲆總膽固醇濃度隨溫度降低整體呈現(xiàn)升高趨勢,8℃時濃度低于初始水平,其余各組濃度均高于初始水平,3℃時濃度最高為(8.02±1.05)mmol/L,顯著高于初始水平(P＜0.05),其余各實驗組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

由圖3B可知,甘油三酯濃度隨溫度降低呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,各實驗組的濃度均高于初始水平,且各實驗組之間無顯著差異(P＞0.05)。

由圖4A可知,高密度脂蛋白膽固醇的濃度開始時隨溫度下降而升高,當溫度降到 5℃時,濃度達到最高(5.74±0.42)mmol/L,溫度再降低時,高密度脂蛋白濃度隨之降低,但都高于18℃時的初始濃度。5℃實驗組的高密度脂蛋白濃度和 18℃實驗組之間存在顯著差異(P＜0.05),其余各組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

由圖4B可知,低密度脂蛋白膽固醇的濃度隨溫度降低整體呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢,當溫度降到 5℃時,濃度達到最低值(4.50±1.62)mmol/L,繼續(xù)降低至 3℃時,濃度達到最高值(6.72±2.42)mmol/L,各實驗組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.4 連續(xù)降溫對大菱鲆代謝產(chǎn)物的影響

由圖5A可知,隨溫度降低尿素濃度先降低后升高再降低,在8℃時濃度達最高值(3.34±0.03)mmol/L,在1℃時降到最低值(0.58±0.03)mmol/L,且1℃時的濃度值顯著低于 8℃時(P＜0.05),其余各組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

圖3 連續(xù)降溫對大菱鲆血清總膽固醇濃度和甘油三酯濃度的影響Fig.3 Effects of continuous cooling on concentrations of serum total cholesterol and serum triglyceride in Scophthalmus maximus

圖4 連續(xù)降溫對大菱鲆血清高密度脂蛋白膽固醇濃度和低密度脂蛋白膽固醇濃度的影響Fig.4 Effects of continuous cooling on concentrations of serum high density lipoprotein cholesterol and low density lipoprotein cholesterol in Scophthalmus maximus

由圖 5B可知,乳酸含量隨溫度降低呈現(xiàn)升高趨勢,降到 5℃時達到最高值為(0.615±0.11)mmol/g,18℃時濃度達到最低值為(0.523±0.087)mmol/g,18℃組與 5℃組之間存在顯著差異(P＜0.05),其余各實驗組之間沒有顯著性差異。

3 討論

3.1 連續(xù)降溫對大菱鲆血清蛋白質(zhì)含量的影響

血清中的總蛋白主要包括白蛋白和球蛋白,白蛋白主要由肝臟合成,有維持血漿滲透壓、參與機體免疫、運輸、營養(yǎng)等功能,球蛋白由淋巴細胞轉(zhuǎn)化成的漿細胞分泌形成,在機體的特異性免疫中發(fā)揮重要作用[17-19]。本實驗中,溫度降到 8℃以下時,總蛋白和白蛋白隨溫度降低均有逐漸升高的趨勢,可能是隨著溫度降低,大菱鲆受到冷刺激處于應激狀態(tài),肝臟開始合成應激蛋白,而到1℃時白蛋白濃度又降低,可能是此時的溫度已超過了大菱鲆的耐受范圍,肝臟開始受損,各種代謝酶的活性受到抑制。這與常玉梅等[17-20]的觀點一致。

3.2 連續(xù)降溫對魚體血糖和肝糖原的影響

圖5 連續(xù)降溫對大菱鲆血清尿素濃度和肌肉乳酸濃度的影響Fig.5 Effects of continuous cooling on concentrations of serum urea and lactic acid of muscle in Scophthalmus maximus

血糖是機體的主要供能物質(zhì),正常情況下,其在血液中的含量在一定范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定。一些研究發(fā)現(xiàn),應激狀態(tài)下,魚體的血糖含量明顯升高,產(chǎn)生高血糖癥[21-25],當環(huán)境溫度下降早期,生物體內(nèi)的適應性變化以血糖代謝增加為主,即體內(nèi)的糖元轉(zhuǎn)化為葡萄糖量增加,產(chǎn)生熱量以增強御寒功能,機體在代謝產(chǎn)熱過程中,血糖大量消耗,機體和臟器組織的抗寒能力下降[17,26]。隨著低溫脅迫的加強或脅迫時間的延長,機體將大量的葡萄糖分解成三磷酸腺苷(ATP)提供能量,又使葡萄糖濃度下降。本實驗中葡萄糖的變化規(guī)律與此規(guī)律相符,在 8～3℃實驗組的血清葡萄糖濃度顯著高于其余實驗組,說明在3℃之前大菱鲆處于應激狀態(tài),溫度降低血糖含量升高以增強魚體的抗脅迫能力,當溫度繼續(xù)降低到 3℃以下,大菱鲆機體葡萄糖代謝酶活性降低,使葡萄糖產(chǎn)生量減少且大部分血糖被分解生成 ATP,消耗量增加,使血糖總量減少,而 1℃實驗組與對照組無顯著差異。

肝糖原含量的變化與血清葡萄糖含量變化趨勢一致,原因可能是: 血清葡萄糖濃度的升高意味著需要更多的糖原分解提供葡萄糖,而魚體內(nèi)血清葡萄糖一般是由肝糖原分解提供[21,27],所以為滿足血清葡萄糖含量的增加,肝臟也增加了肝糖原的合成量。

3.3 連續(xù)降溫對魚體脂類的影響

血液高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇分別是高、低密度脂蛋白中結合的膽固醇,能相應反映高、低密度脂蛋白的多少。血液中總膽固醇的含量應該是高、低密度脂蛋白綜合作用的結果,高密度脂蛋白的合成和分泌在肝臟和腸內(nèi)進行,本實驗中,隨溫度降到 5℃時,高密度脂蛋白含量顯著升高而使更多的血液膽固醇被轉(zhuǎn)運至肝臟,從而使3℃時的血漿膽固醇含量降低,但是低密度脂蛋白含量升高則會將更多的膽固醇和甘油三酯轉(zhuǎn)運到血液中,二者綜合作用使得血清總膽固醇含量升高[26,28]。

低密度脂蛋白能將甘油三酯運送至血液,所以低密度脂蛋白的含量會對血清中甘油三酯的含量產(chǎn)生影響,這一關系表現(xiàn)為甘油三酯與低密度脂蛋白隨溫度降低變化趨勢一致。

甘油三酯是植物和動物細胞貯脂的主要形式,溫度急劇下降會減弱魚體細胞膜的脂流動性和彈性而使膜損壞或通透性增加,因此細胞膜的脂組成和結構會影響細胞的抗寒性[12,17]。魚類的脂肪酸代謝對體溫降低的適應很敏感,通過積累磷脂中長鏈不飽和脂肪酸的含量,使膜在低溫脅迫時仍保持穩(wěn)定性和流動性[29-33],從而提高自身的抗寒能力。本研究通過連續(xù)降溫實驗發(fā)現(xiàn),與常溫的對照組相比,降溫組的甘油三酯的含量都有增加但無顯著性差異,這說明連續(xù)降溫對魚體細胞膜沒有實質(zhì)性的損害。

3.4 連續(xù)降溫對代謝產(chǎn)物的影響

尿素是蛋白質(zhì)和氨基酸在代謝過程中脫去氨基,由氨基代謝生成[17,34],此過程在肝臟中進行。本實驗中,除 8℃組外,其余各組與對照組相比含量都有所降低,可能與溫度降低導致體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝速率降低,尿素產(chǎn)量減少有關。大菱鲆的溫度耐受范圍大約在 20～8℃,8℃是尿素濃度變化的一個轉(zhuǎn)折點,一定程度上說明8℃是大菱鲆適溫范圍的下限。

氧氣不足情況下,肌肉通過糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸并且迅速提供能量。血液流速緩慢、氧氣攝入量不足以及劇烈的運動都會導致體內(nèi)乳酸含量升高[21,35]。劉偉東[36]研究發(fā)現(xiàn),大菱鲆在低溫保活過程中隨時間的延長,呼吸頻率迅速降低,鰓的煽動幅度也隨?；顣r間逐漸減弱,呼吸頻率降低使氧氣的吸入量減少,部分組織器官出現(xiàn)無氧代謝使乳酸生成量增多,并且低溫時,魚體內(nèi)的新陳代謝逐漸降為較低水平,乳酸的代謝受阻,乳酸生成量的增多和排出量的減少都將導致肌肉中乳酸含量的增多[37],這與本實驗研究結果一致。

4 小結

綜合分析實驗中大菱鲆機體代謝指標變化趨勢發(fā)現(xiàn): 當溫度在 18～8℃范圍時,為抵御溫度降低,大菱鲆體內(nèi)相應代謝開始發(fā)生改變以抵消低溫對魚體產(chǎn)生的不利影響,此時,由于溫度范圍在大菱鲆的耐受范圍之內(nèi),大菱鲆通過調(diào)節(jié)自身的代謝能夠維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定,因而在此溫度范圍內(nèi)并未出現(xiàn)應激反應;當溫度降到8～3℃時,此溫度范圍已超過大菱鲆的正常生活溫度,內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定受到一定的影響,體內(nèi)開始出現(xiàn)應激反應,某些指標濃度相對于初始降溫有顯著性差異;當溫度繼續(xù)低到 1℃時,各指標濃度基本處于較低狀態(tài),說明在此低溫度區(qū)間內(nèi),大菱鲆體內(nèi)各種代謝反應的酶活力降到極低程度,體內(nèi)的應激反應和各種代謝反應基本處于停滯狀態(tài),說明 3～1℃溫度區(qū)間與大菱鲆的生態(tài)冰溫點比較接近,在此溫度區(qū)間大菱鲆代謝程度極低,接近于半休眠或休眠狀態(tài),可以在此溫度區(qū)間附近進一步進行無水保活的探索,在保證大菱鲆無水運輸可行性的基礎上優(yōu)化經(jīng)濟成本。

肌肉中乳酸含量過高會影響魚體口感,這是冰溫運輸中產(chǎn)生的負面影響,在以后的研究和實踐過程中應引起注意。

低溫無水?；钸\輸還有很多有待深入研究的工作: 篩選機體內(nèi)較靈敏的代謝指標來反映低溫運輸過程中魚體內(nèi)的代謝狀況,探索大菱鲆的降溫生理極限及其在無水低溫運輸過程中的耐受時間,同時無水低溫運輸過程中產(chǎn)生的負面影響也是不可忽視,值得深入探索的。

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