周曉靚，王浩，李衛(wèi)紅，施培基，周則衛(wèi)

(中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所藥物室，天津 300192)

·制藥技術·

7β-苯乙酰胺-3-頭孢美法侖-4-頭孢烷酸的合成*

周曉靚，王浩，李衛(wèi)紅，施培基，周則衛(wèi)

(中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所藥物室，天津 300192)

美法侖與二苯基重氮甲烷經回流反應制得美法侖二苯甲酯(3);首次采用7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-頭孢烷酸對甲氧基芐酯與3在DBU作用下經“一鍋法”反應后水解合成了前體藥物頭孢美法侖(7β-苯乙酰胺-3-頭孢美法侖-4-頭孢烷酸)，其結構經1H NMR和ESI-MS確證。

前藥;頭孢菌素;美法侖;藥物;合成

化療是當前治療惡性腫瘤的重要手段之一。如何增加化療藥物在腫瘤的局部濃度同時降低全身暴露濃度是當前腫瘤靶向治療的熱點?？贵w導向酶解前藥治療(ADEPT)可在增加靶細胞藥物濃度的同時降低正常組織的藥物濃度，減少化療引起的毒副作用并提高療效。在ADEPT研究系統(tǒng)中，根據β-內酰胺酶的生化特點和頭孢菌素的化學結構特點，選擇β-內酰胺酶為活化酶，頭孢菌素拼合細胞毒化合物作為底物，在ADEPT研究中較為常見［1-2］。頭孢美法侖(6)是將頭孢菌素與氮芥類非特異性抗腫瘤藥物拼合而成的前體藥物，在β-內酰胺酶的特異性作用下可以轉化為原型藥物美法侖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

文獻［3］方法中，6的合成以7-ACA為原料制得重要活性中間體7-羥甲基頭孢后，再與美法侖(1)進行偶聯(lián)而得。該方法合成步驟多，涉及多個活性基團的保護和去保護。

本文以1與二苯基重氮甲烷(2)經回流反應制得美法侖二苯甲酯(3)后;首次采用7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-頭孢烷酸對甲氧基芐酯(GCLE，4)為原料，與3在1，8-二氮雜二環(huán)［5.4.0］十一碳-7-烯(DBU)作用下經“一鍋法”反應后水解合成了用于腫瘤靶向治療的前藥6(Scheme 1)，其結構經1H NMR和ESI-MS確證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian Mercury Vx-300型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標);WATERS ALLIANCE型高效液相色譜儀［ODS柱(4.5 mm×250 mm)，流動相:甲醇/乙酸胺緩沖液/乙酸=80/20/1，流速: 1.0 mL·min-1，檢測波長:254 nm］。

2 按文獻［4］方法合成;1，蘇州立德化學有限公司;4，天津津康藥業(yè)有限公司;DBU，北京偶合科技有限公司;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)3的合成

在反應瓶中依次加入丙酮30 mL和1 1.2 g (3.9 mmol)，攪拌使其呈混懸液;緩慢加入新制的2(12 mmol)的正己烷(12 mL)溶液，加畢，回流反應2 h［TLC監(jiān)測，展開劑:A=V(乙酸乙酯)∶V(環(huán)己烷)=4∶1］。過濾，濾液減壓濃縮后經加壓硅膠柱層析(梯度洗脫劑:A=1∶1～1∶0)純化得黃色油狀物3 1.4 g，收率76%，Rf=0.2(展開劑:A=1∶1);1H NMR δ:7.36～7.22(m，10H)，6.94～6.90(m，2H)，6.49～6.47(d，J=8.4 Hz，2H)，3.84～3.79(m，1H)，3.70～3.55(m，8H)， 3.06～3.00(dd，J=5.7 Hz，5.4 Hz，1H)，2.90～2.83(dd，J=6.9 Hz，7.2 Hz，1H)，1.94(br，2H)。

(2)7β-苯乙酰胺-3-頭孢美法侖-4-頭孢烷酸對甲氧基芐酯(5)的合成

在反應瓶中依次加入DMF 15 mL和4 1.0 g (2 mmol)，攪拌使其呈混懸液;加入3 1.3 g(2 mmol)，于-5℃加入碘化鉀0.8 g(4.8 mmol)，緩慢滴加DBU 600 μL，滴畢，避光反應5 h(TCL監(jiān)控，反應液顏色逐漸加深)。用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并萃取液，依次用10%硫代硫酸鈉溶液、10%檸檬酸水溶液和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮后經加壓硅膠柱層析(梯度洗脫劑:A=1∶1～1∶0)純化得淡黃色固體5 750 mg，收率40%，Rf=0.35(展開劑:A=1∶1);1H NMR δ:7.37～7.26(m，18H)，7.01～6.98 (d，J=5.7 Hz，2H)，6.80(s，2H)，6.52～6.49 (d，J=9.0 Hz，2H)，6.05～6.02(d，J=9.0 Hz，1H)，5.85～5.80(m，1H)，5.35～5.34 (dd，J=4.2 Hz，5.7 Hz，1H)，4.89～4.88(d，J=5.1 Hz，1H)，4.12～3.55(m，16H)，3.21～3.15(dd，J=8.4 Hz，9.6 Hz，2H)，1.70(s，2H);ESI-MS m/z:920.291 1［M+］。

(3)6的合成

在反應瓶中依次加入二氯甲烷5 mL和5 400 mg(0.43 mmol)，攪拌使其溶解;加入苯甲醚1 mL，冰浴冷卻下緩慢滴加三氟乙酸(TFA)1 mL(5 min)，滴畢，于室溫反應30 min。傾入50 mL冷的異丙醚(析出淡黃色固體)，離心(2 500 rpm，10 min)分離得5的三氟乙酸鹽，經硅膠柱層析(洗脫劑:乙醇)純化得類白色固體6 120 mg，含量93.53%(T=3.341 min)，Rf=0.75［展開劑:V(乙醇)∶V(乙酸)=10∶1］;UV:259.7 nm，301.3 nm;1H NMR δ:8.51(s，1H)，8.21(d，J=8.3 Hz，1H)，7.31～7.30(m，5H)，6.97(s，2H)，6.59～6.56(d，J=8.7 Hz，2H)，5.61～5.59(dd，J=4.8 Hz，1H)，5.12～5.07(d，J=13.8 Hz，1H)，4.82～4.80(d，J=4.8 Hz，1H)，4.58～4.54(d，J=13.3 Hz，1H)，4.05～4.01(m，1H)，3.76～3.21(m，12H)，3.00(dd，1H)，2.70(dd，1H);ESI-MS m/z:631.27{［M-3H］3-}。

2 結果與討論

2.1 合成

文獻報道6的合成以7-ACA為原料，需要合成主要中間體3-羥甲基頭孢烷酸，然后與1，2，2，2-四氯乙基氯甲酸(Ⅰ)反應制得活性中間體3-四氯甲基氯甲酸酯，最后與1的氨基反應合成偶聯(lián)化合物。該路線步驟長，Ⅰ為進口試劑，獲得困難。本文以4為原料，利用DBU“一鍋法”反應制得偶聯(lián)化合物，大大縮短了實驗路線。

在頭孢美法侖的偶聯(lián)反應(3→5)中，對1的羧酸成酯進行保護，如果使用未保護的1進行偶聯(lián)反應，所得優(yōu)勢產物為頭孢菌素3-位氯甲基與1的羧酸反應成酯產物(Ⅱ)，在TFA水解過程中酯鍵會斷裂生成3-甲基頭孢菌素(Ⅲ)和1 (Scheme 2)。

頭孢菌素衍生物合成難度主要表現(xiàn)為對酸堿不穩(wěn)定，反應產物難于重結晶，純化困難等。本路線中的4在堿性條件下易發(fā)生2-位和3-位的雙鍵易位［5］，因此偶聯(lián)反應中的縛酸劑的選擇很關鍵。常用的K2CO3和三乙胺等堿均可能帶來雙鍵易位的副產物，難以通過柱層析分離。而DBU則能夠避免雙鍵易位，制得較為單一的產物。

本文首次通過一鍋法以4為原料合成了頭孢美法侖前藥6，以DBU為縮合劑避免了副產物生成，簡化了合成路線。

該路線也可能用于其他頭孢菌素衍生物的合成改造，為腫瘤靶向治療ADEPT的研究提供了化學基礎。

［1］David E Kerr，Zhengong Li，Nathan O Siemers，et al．Development and activities of a new melphalan prodrug designed for tumor-selective activation［J］.Bioconj Chem，1998，2:255-259.

［2］Ralph F Alderson，Brian E Toki，Roberge M，et al．Characterization of a CC49-based single-chain fragment-β-lactamase fusion protein for antibody-directed enzyme prodrug therapy(ADEPT)［J］.Bioconj Chem，2006，17:410-418.

［3］Brian E Toki，Peter D Senter.Melphalan Prodrug ［P］.US 20 050 214 310，2005.

［4］呂茜茜，周曉靚，王榮先.二苯基重氮甲烷的合成［J］.化學試劑，2008，30(2):147-147.

［5］Ryan M Phelan，Marc Ostermeier，Craig A Townsend. Design and synthesis of a β-lactamase activated 5-fuorouracil prodrug［J］.Bioorg Med Chem Lett，2009，19:1261-1263.

Synthesis of 7β-Phenethyl Carboxamido-3-melphalan-4-cephalosporin

ZHOU Xiao-liang，WANG Hao，LI Wei-hong，SHI Pei-ji，ZHOU Ze-wei

(Pharmceutical department，Institute of Radiation Medicine，Chinese Academy of Medical Sciences，Tianjin 300192，China)

Melphalan diphenylmethyl ester(3)was synthesized by reflux of Melphalan with diphenyldiazomethane.A cephalosporin-mustard prodrug，Cephalosporin melphalan(7β-Phenethyl Carboxamido-3-melphalan-4-cephalosporin)，was synthesized by“one-pot”reaction of 7-phenylacetamide-3-chloromethylcephalosporanic acid p-methoxybenzyl ester with 3 and then hydrolysis for the first time. The structure was confirmed by1H NMR and ESI-MS.

prodrug;cephalosporin;Melphalan;synthesis

O621.3;R914.5

A

1005-1511(2014)03-0416-03

2013-12-25;

2014-04-17

國家自然科學基金資助項目(81301983);研究所發(fā)展基金資助項目(SF1305)

周曉靚(1979-)，女，回族，寧夏石嘴山人，博士研究生，助理研究員，主要從事頭孢菌素類靶向前藥及輻射防護藥的合成研究。Tel.022-85683041，E-mail:zhouxiaoliang@irm-cams.ac.cn

王浩，E-mail:wanghao@irm-cams.ac.cn