李文彬，董 妍，閆小寧，李美紅，劉燕婷，趙一丁

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710003；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710004)

他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

李文彬1，董 妍2，閆小寧1，李美紅1，劉燕婷1，趙一丁1

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710003；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710004)

目的評(píng)價(jià)他克莫司對(duì)人表皮黑素細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)及基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMP-2、MMP-9)表達(dá)的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組和他克莫司(10、102、103、104nmol/L)處理組，采用Q-RT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)不同濃度他克莫司對(duì)10 ng/m L腫瘤壞死因子-α(TNF-α)預(yù)處理后黑素細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響，及他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)；他克莫司(10、102、103、104nmol/L)可以促進(jìn)黑素細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論他克莫司可能通過(guò)抑制ICAM-1表達(dá)及促進(jìn)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，減少免疫損傷及促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移，這可能是其臨床有效治療白癜風(fēng)的機(jī)制之一。

他克莫司；細(xì)胞間粘附分子-1；基質(zhì)金屬蛋白酶；黑素細(xì)胞

白癜風(fēng)是一種由于黑素細(xì)胞損傷導(dǎo)致皮膚及毛囊黑色素脫失的獲得性皮膚病。自身免疫異常是白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制之一，其中T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)黑素細(xì)胞損傷在發(fā)病中發(fā)揮著重要作用［1］。因此，阻止黑素細(xì)胞與淋巴細(xì)胞粘附與促進(jìn)皮損周圍正常黑素細(xì)胞向皮損部位遷移是白癜風(fēng)治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)與白癜風(fēng)的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞與黑素細(xì)胞粘附，從而導(dǎo)致黑素細(xì)胞的破壞［2］。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類依賴鈣鋅等離子的內(nèi)肽酶，其活性與細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)［3］。

他克莫司是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，可通過(guò)抑制T細(xì)胞活化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［4］。他克莫司軟膏可有效促進(jìn)白癜風(fēng)皮損復(fù)色，但機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司可促進(jìn)黑素細(xì)胞黑素合成和酪氨酸酶活性［5］。在此基礎(chǔ)上本研究將繼續(xù)觀察他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞的生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)作用，為臨床治療白癜風(fēng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人表皮黑素細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院饋贈(zèng)；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青生物科技有限公司；他克莫司、TNF-α、胰蛋白酶溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；黑素細(xì)胞M254基礎(chǔ)培養(yǎng)基、黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加物HMG、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自Ta KaRa公司；鼠抗ICAM-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；鼠抗MMP-2、鼠抗MMP-9單抗購(gòu)自Santa Cruze公司；兔抗β-actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、ECL化學(xué)發(fā)光顯色劑購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 黑素細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 將培養(yǎng)瓶中的黑素細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化后，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，離心去上清，加入含50 m L/L的FBS，100 U/m L青霉素和100μg鏈霉素，b FGF的M254培養(yǎng)基的黑素細(xì)胞培養(yǎng)液中接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、50 m L/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將黑素細(xì)胞以密度為5×104接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍后加入少量PBS液；他克莫司組：添加含不同濃度他克莫司(10、102、103、104nmol/L)的培養(yǎng)液。對(duì)照組：添加黑素細(xì)胞培養(yǎng)液；每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-RT-PCR）檢測(cè) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞cDNA。PCR反應(yīng)引物序列：ICAM-1：5'-GCAGACCACTGTGCTTTGAG-3'，5'-GCAGACCACTGTGCTTTGAG-3'；MMP-2：5'-CACTTTCCTGGGCAACAAAT-3'，5'-TGATGTCATCCTGGGACAGA-3'；MMP-9：5'-TTCAAGGCTGGGAAGTACTG-3'，5'-TCCGGAGGGCCCCGGTCACCT-3'；βactin：5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'；5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'。引物序列由上海生工合成。按照SYBR?Premix Realtime PCR Mix試劑說(shuō)明使用BioRad iQ5 and MyiQTMReal Time PCR Detection System完成Real time PCR反應(yīng)；每一樣本同時(shí)進(jìn)行3個(gè)PCR反應(yīng)檢測(cè)，用內(nèi)參βactin對(duì)ICAM-1、MMP-2、MMP-9的m RNA表達(dá)水平做標(biāo)準(zhǔn)化處理；用Bio Rad iQ5 PCR儀所帶統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(統(tǒng)計(jì)方法為△△Ct法，基因的相對(duì)表達(dá)按2-△△Ct)，以比較標(biāo)準(zhǔn)化后各組ICAM-1、MMP-2、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)體系采用兩步法在BioRad iQ5 and MyiQTMReal Time PCR Detection System完成Real time PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min，PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，95℃10 s，55℃30 s。

1.2.4 Western blotting檢測(cè) 取20μg蛋白樣品，用120 g/L SDS-PAGE進(jìn)行電泳，然后在電轉(zhuǎn)移裝置上，100 V恒壓轉(zhuǎn)移1 h。將PVDF膜置于含50 g/L脫脂牛奶的TBS-T溶液中4℃封閉過(guò)夜；ICAM-1、MMP-2、MMP-9和β-actin一抗分別用TBS-T按1∶2 000和1∶1 000稀釋，膜置于一抗稀釋液中室溫緩慢搖動(dòng)1 h，二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG多克隆抗體用TBS-T按1∶200稀釋，膜在二抗稀釋液中室溫慢搖1 h。暗室內(nèi)ECL發(fā)光檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)有4個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。對(duì)正態(tài)分布且方差齊的資料采取單因素方差分析檢驗(yàn)，若統(tǒng)計(jì)量F值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，各組間均數(shù)兩兩比較采取LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響為了觀察他克莫司對(duì)TNF-α誘導(dǎo)黑素細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的作用，本研究根據(jù)文獻(xiàn)［6］選用10 ng/mL TNF-α預(yù)處理實(shí)驗(yàn)各組黑素細(xì)胞誘導(dǎo)其ICAM-1呈過(guò)表達(dá)，孵育72 h后采用Q-RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同濃度組與對(duì)照組相比，黑素細(xì)胞ICAM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或＜0.01，表1)。

2.2 他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)的影響采用濃度為10 ng/m L TNF-α作用于實(shí)驗(yàn)各組黑素細(xì)胞，孵育72 h后采用Western blotting檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)各組條帶與內(nèi)參β-actin蛋白條帶吸光度校正分析后表明，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)各組與對(duì)照組相比，黑素細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或＜0.01，圖1)。

表1 不同濃度他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響Tab.1 Effects of different concentration of tacrolimus on the expression of ICAM-1 mRNA in melanocytes(2-△△Ct)

圖1 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)Fig.1 Detection of ICAM-1 protein expression using Western blotting

2.3 他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞孵育72 h后行Q-RTPCR檢測(cè)，結(jié)果表明，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同濃度組黑素細(xì)胞MMP-2、MMP-9 m RNA的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或＜0.01，表2)。

表2 他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響Tab.2 Effects of different concentration of tacrolimus on the expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA in melanocytes (2-△△Ct)()

表2 他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響Tab.2 Effects of different concentration of tacrolimus on the expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA in melanocytes (2-△△Ct)()

與對(duì)照組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別n MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA 104nmol/L他克莫司4 2.88±0.12**4.73±1.06**103nmol/L他克莫司4 2.29±0.05**4.29±1.21**102nmol/L他克莫司4 1.95±0.06*3.15±0.63**10 nmol/L他克莫司4 1.41±0.05*2.54±0.13*對(duì)照組4 0.23±0.03 1.03±0.07

2.4 他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞孵育72 h后Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)各組條帶與內(nèi)參β-actin蛋白條帶吸光度校正分析后表明，他克莫司10 nmol/L組細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2)；他克莫司(102、103、104nmol/L)不同濃度組與對(duì)照組相比，黑素細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或＜0.01，圖2)；他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同濃度組與對(duì)照組相比，黑素細(xì)胞MMP-9蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或＜0.01，圖2)。

圖2 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)Fig.2 Detection of MMP-2 and MMP-9 protein expressions using Western blotting

3 討 論

白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制仍不明確，其發(fā)病可能與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫密切相關(guān)［7-8］。細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)現(xiàn)統(tǒng)一命名為CD54，是一種重要的免疫球蛋白樣的粘附分子，具有多種生物學(xué)功能，參與許多自身免疫性疾病的發(fā)生。研究表明，ICAM-1介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用是白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞破壞的重要途徑之一，其過(guò)程包括通過(guò)成對(duì)的黏附分子作用與效應(yīng)淋巴細(xì)胞結(jié)合，靶抗原與其他細(xì)胞表面標(biāo)志共同活化白細(xì)胞表面受體及觸發(fā)細(xì)胞毒性作用等［9］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)皮損及血清中ICAM-1的水平對(duì)白癜風(fēng)的發(fā)病過(guò)程及判斷疾病的活動(dòng)性具有一定的指導(dǎo)意義［10］。ICAM-1在正常黑素細(xì)胞中表達(dá)水平較低，但在某些致炎因子誘導(dǎo)下(如TNF-α、白介素-1、脂多糖、干擾素-γ)黑素細(xì)胞ICAM-1可呈高表達(dá)，并與其在T細(xì)胞表面的配體LFA-1相結(jié)合從而促進(jìn)T細(xì)胞活化與粘附。TNF-α是一種重要的前炎癥性細(xì)胞因子，與許多炎癥性疾病、自身免疫疾病及腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，可能在白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著一定作用。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以抑制黑素細(xì)胞的增殖和黑素合成，同時(shí)TNF-α在白癜風(fēng)患者的血清中及皮損中的表達(dá)均呈過(guò)表達(dá)，并與ICAM-1表達(dá)相一致［11］。

他克莫司作為一種免疫抑制劑，其治療白癜風(fēng)機(jī)制可能是通過(guò)阻斷鈣調(diào)磷酸酶抑制T淋巴細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減少局部黑素細(xì)胞受損。為了探求他克莫司免疫抑制作用是否與ICAM-1相關(guān)，本研究在體外模仿白癜風(fēng)體內(nèi)病理環(huán)境，選用10 ng/mL的TNF-α作用于黑素細(xì)胞，誘導(dǎo)其ICAM-1表達(dá)，然后觀察他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響。結(jié)果表明，他克莫司從ICAM-1基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平上均可抑制TNF-α誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，提示他克莫司可能通過(guò)抑制ICAM-1表達(dá)，從而減弱淋巴細(xì)胞對(duì)黑素細(xì)胞的毒性作用。

白癜風(fēng)皮損處黑素細(xì)胞消失，其復(fù)色須經(jīng)過(guò)毛囊黑素細(xì)胞儲(chǔ)庫(kù)中前體黑素細(xì)胞活化、增殖及向皮損處遷移。其中黑素細(xì)胞遷移經(jīng)過(guò)與胞外基質(zhì)粘附、增殖、基質(zhì)降解、遷移的過(guò)程。MMP是一類鋅、鈣離子指依賴性內(nèi)肽酶，其活性成分可降解許多細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原、明膠、纖維蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移，其中MMP-2、MMP-9的主要作用是降解基底膜Ⅳ型膠原和纖維粘蛋白和層粘連蛋白。研究表明，MMP-2、MMP-9可降解Ⅳ型膠原蛋白并與惡性黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性密切相關(guān)［12］。目前關(guān)于MMP與白癜風(fēng)黑素細(xì)胞的遷移功能的研究較少。LAN等［13-14］認(rèn)為，他克莫司可能通過(guò)間接誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌MMP的活性增加從而形成有利于黑素細(xì)胞遷移的環(huán)境；或者通過(guò)誘導(dǎo)黑素母細(xì)胞向黑素細(xì)胞分化促進(jìn)白癜風(fēng)復(fù)色。近來(lái)，LEE等［15］采用明膠酶譜法發(fā)現(xiàn)他克莫司直接通過(guò)增加MMP-2、MMP-9的活性促進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移。本研究采用Q-RT-PCR及Western blotting方法進(jìn)一步證實(shí)他克莫司可能從mRNA及蛋白的表達(dá)水平上誘導(dǎo)黑素細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)，提示他克莫司可能通過(guò)促進(jìn)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞儲(chǔ)庫(kù)中前體黑素細(xì)胞向皮損區(qū)遷移從而使白癜風(fēng)皮膚復(fù)色。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)他可莫司可以抑制炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞ICAM-1表達(dá)，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)MMP-2、MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)。因此，我們推測(cè)他克莫司可能通過(guò)抑制ICAM-1介導(dǎo)的黑素細(xì)胞免疫損傷及增強(qiáng)黑素細(xì)胞的遷移能力來(lái)治療白癜風(fēng)，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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(編輯 卓選鵬)

The effects of tacrolimus on ICAM-1，MMP-2 and MMP-9 expressions in human melanocytes

LI Wen-bin1，DONG Yan2，YAN Xiao-ning1，LI Mei-hong1，LIU Yan-ting1，ZHAO Yi-ding1
(1.Department of Dermatology，Shaanxi TCM Hospital，Xi'an 710003；2.the Second Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China)

ObjectiveTo evaluate the effects of tacrolimus on intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)，MMP-2 and MMP-9 expressions in human melanocytes.MethodsIn the experiment melanocytes were divide into normal control group and tacrolimus groups(10，102，103and 104nmol/L).Q-RT-PCR and Western blotting were performed to evaluate the effects of tacrolimus on ICAM-1 expression induced by TNF-α(10 ng/m L)and on MMP-2 and MMP-9 expressions in melanocytes.ResultsCompared with that in control group，the expression of ICAM-1 was suppressed markedly in all the tacrolimus groups(P＜0.05，P＜0.01).However，the expressions of MMP-2 and MMP-9 were increased in all the tacrolimus groups(P＜0.05，P＜0.01).ConclusionTopical tacrolimus can be used as an effective agent to treat vitiligo，maybe due to its inhibiting ICAM-1 expression and inducing MMP-2 and MMP-9 expressions，which can reduce immunologic injury and facilitate migration of menalocytes.

tacrolimus；intercellular adhesion molecule-1；matrix metalloproteinase；melanocyte

R751

A

1671-8259(2014)05-0682-04

10.7652/jdyxb201405023

2014-01-02

2014-04-13

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2013JM4043) Supported by the Natural Science Foundation of Shaanxi Province(No.2013JM4043)

李文彬(1973-)，男(漢族)，博士，主治醫(yī)師.研究方向：白癜風(fēng)、銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究.E-mail：boerge@sina.com

時(shí)間：2014-07-22 16∶33 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1633.012.html