周 艷，牟寬厚，韓 丹，李 玥，侯衛(wèi)坤，馬亞梅，呂社民

(西安交通大學醫(yī)學院：1.第一附屬醫(yī)院皮膚科，2.遺傳學與分子生物學系，陜西西安 710061；3.西安市紅會醫(yī)院關節(jié)外科，陜西西安 710054)

苦參堿可抑制Th17所誘導的角質形成細胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表達

周 艷1，牟寬厚1，韓 丹1，李 玥2，侯衛(wèi)坤3，馬亞梅1，呂社民2

(西安交通大學醫(yī)學院：1.第一附屬醫(yī)院皮膚科，2.遺傳學與分子生物學系，陜西西安 710061；3.西安市紅會醫(yī)院關節(jié)外科，陜西西安 710054)

目的考察苦參堿(matrine，Mat)對Th17誘導的角質形成細胞(keratinocytes，KC)系HaCa T細胞白細胞介素-17受體A(IL-17RA)、白細胞介素-21受體(IL-21R)及白細胞介素-22受體1(IL-22R1)表達的影響。方法培養(yǎng)HaCaT細胞，用Th17分泌的主要效應因子IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22(10 ng/m L)聯(lián)合刺激HaCaT細胞模擬類銀屑病樣細胞模型，再用10μg/mL及100μg/mL的Mat干預此細胞模型，采用RT-qPCR及Western blot方法檢測IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表達變化。結果IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的mRNA及蛋白在HaCaT細胞上有表達。IL-17A、IL-21及IL-22聯(lián)合刺激可以顯著促進HaCaT細胞IL-17RA、IL-21R m RNA及蛋白表達，IL-22R1蛋白的表達量升高(P＜0.05)。Mat單獨干預或與上述細胞因子聯(lián)合干預組與未處理的HaCaT細胞組相比，IL-17RA、IL-21R及IL-22R1表達無顯著下降(P＞0.05)，但可以顯著降低IL-17A、IL-21及IL-22聯(lián)合刺激后所升高的受體蛋白表達(P＜0.05)。結論IL-17A、IL-21及IL-22聯(lián)合刺激角質形成細胞可以增強IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表達，Mat可抑制這種增強作用，可能在多種Th17介導的免疫性皮膚病中發(fā)揮抗炎作用。

苦參堿；Th17細胞因子；白介素-17受體A；白介素-21受體；白介素-22受體1

角質形成細胞(keratinocytes，KC)是許多皮膚病中參與炎癥反應和皮膚免疫的重要免疫細胞［1］。HaCaT細胞株具有與正常KC相似的分化特征，在體外容易培養(yǎng)，可作為體外研究藥物及皮膚病的良好模型［2］。近年來，Th17作為Th細胞的新亞型，參與銀屑病、接觸性皮炎、特應性皮炎等許多皮膚病的免疫發(fā)病機制［3］。Th17細胞主要產(chǎn)生IL-17A、IL-21和IL-22等，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1分別為IL-17A、IL-21和IL-22的主要受體［4-6］。Th17作用于皮膚需要通過激活上述受體而發(fā)揮其作用?？鄥A(matrine，Mat)對多種自身免疫性疾病具有抗炎作用［7］，也可用于炎癥性皮膚疾病的治療，但其作用機制復雜，尤其是其抑炎機制是否與Th17相關尚不清楚。因此，本實驗從Mat對Th17所產(chǎn)生因子的受體影響著手，選擇其作用于皮膚的角質形成細胞作為研究靶點，以期為Mat治療銀屑病等多種皮膚病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑人永生化角質形成細胞(HaCa T細胞)由第四軍醫(yī)大學皮膚科實驗室饋贈，本實驗室保存。RPMI-1640細胞培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胰蛋白酶及EDTA(杭州四季青公司)。Trizol法總RNA抽提試劑盒(Invitrogen，美國)；用于RT-qPCR的IL-17RA、IL-21R及IL-22R1引物(北京奧克公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，日本)；5-Target qPCR Kit(Bio-Rad，美國)；cDNA試劑盒(Fermentas，加拿大)。

Mat注射液(江蘇連云港正大天晴醫(yī)藥有限公司)，臨用時用生理鹽水稀釋成10、100μg/m L作為實驗濃度。細胞因子IL-17A、IL-21及IL-22均購自Peprotech公司(美國)。根據(jù)預實驗結果將10 ng/mL作為實驗濃度。鼠單克隆IL-17RA抗體購自R&D Systems公司(美國)，兔多克隆IL-21R抗體和兔多克隆IL-22R1抗體購自Abcam公司(英國)，GAPDH購自Santa Cruz公司(美國)。

1.2 角質形成細胞的培養(yǎng)HaCa T細胞用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 U/m L青霉素，100 U/m L鏈霉素)，于37℃、50 m L/L CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞達到80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶+0.5 g/L EDTA 37℃進行消化傳代。

1.3 細胞因子及藥物干預以細胞密度1×105個/mL接種于24孔培養(yǎng)板，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞平穩(wěn)生長至70%～80%融合后，換成無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，分別加入Mat(10、100μg/m L)、IL-17、IL-21、IL-22、IL-17+IL-21、IL-17+IL-22、IL-21+ IL-22、IL-17+IL-21+IL-22以及IL-17+IL-21+IL-22+Mat(100μg/m L)進行分組培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24 h。每組平行設3個復孔，對照組為不加藥物的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。24 h后將各組細胞分別離心，收取沉淀的細胞。

1.4 用RT-qPCR法檢測IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的mRNA表達將上述細胞加入1 m L Trizol抽打勻漿；按照標準抽提步驟進行RNA抽提；將樣品逆轉錄為cDNA，建立RT-qPCR反應體系；反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性5 s、退火30 s、72℃延伸15 s，共40個循環(huán)。IL-17RA、IL-21R及IL-22R1引物及內參β-actin引物(北京奧克公司)見表1。應用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光染料技術進行實時定量PCR反應，計算機分析Ct值，用以評定各因子m RNA的表達水平。

表1 RT-qPCR引物信息Tab.1 Information of primers for RT-qPCR

1.5 Western blot法檢測IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的蛋白表達采用改良型RIPA細胞裂解液，即50 mmol/L Tris-HCl，p H 7.4，150 mmol/L NaCl，10 m L/L Triton X-100，0.2 mmol/L EDTA，10 g/L脫氧膽酸鈉，1 g/L十二烷基硫酸鈉(SDS)，加蛋白酶抑制劑(Beyotime，中國)，然后離心5 min。BCA方法測定細胞總蛋白濃度，按常規(guī)方法進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜并封閉后，分別加入鼠單克隆IL-17RA抗體(稀釋成1∶1 000)，兔多克隆IL-21R抗體(1∶1 000)和兔多克隆IL-22R1抗體(1∶1 000)1 m L，4℃過夜。再加入HRP標記的抗小鼠或抗兔的二抗(1∶1 000)1 m L，室溫孵育1 h，洗膜、顯影，置UVP成像系統(tǒng)中攝影，分析目的基因與內參基因GAPDH的條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行處理，實驗重復3次，采用方差分析及t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 IL-17A、IL-21及IL-22單獨及聯(lián)合干預HaCaT細胞時其受體mRNA的表達變化IL-17RA、IL-21R及IL-22R1 mRNA在HaCaT細胞上有明顯表達。IL-17A、IL-21及IL-22單獨、2因子以及3因子聯(lián)合作用HaCaT細胞時，各處理組其靶向受體mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，IL-17A和IL-21單獨及3因子聯(lián)合作用均可誘導其靶向受體表達增高，與正常對照比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 Th17細胞因子單獨及聯(lián)合干預HaCaT細胞時對其靶向受體mRNA表達的影響Fig.1 Effects of Th17 cytokines treatment alone or in combination on the m RNA expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells

2.2 Mat對HaCaT細胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1 mRNA表達的影響10、100μg/m L的Mat刺激HaCa T細胞24 h后，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1與正常對照組相比，m RNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)。

IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22 (10 ng/m L)聯(lián)合刺激可使IL-17RA mRNA的表達量上調95.25%，IL-21R mRNA的表達量上調171.2%，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；可使IL-22R1 mRNA的表達量上調55.98%，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Mat(10μg/mL)及Mat(100μg/mL)分別可以使經(jīng)上述細胞因子聯(lián)合刺激后所上調的IL-17RA mRNA顯著下降120.5%及144.6%(P＜0.01)；IL-21R mRNA顯著下降238.9%及242%(P＜0.01)；IL-22R1 mRNA顯著下降了108.6%及90.03%(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。Mat(100μg/m L)與Th17分泌的3種細胞因子(10 ng/mL)聯(lián)合干預后，仍可使經(jīng)細胞因子刺激后所上調IL-17RA m RNA的表達下調77.27%(P＜0.05)，IL-21R m RNA的表達下調146.7%(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；IL-22R1 mRNA的表達下調無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)。

圖2 Mat對Th17細胞因子干預后HaCaT細胞表達IL-17RA、IL-21R及IL-22R1 mRNA的影響Fig.2 Effects of Mat on the mRNA expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells treated with Th17 cytokines

2.3 Mat對HaCaT細胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1蛋白表達的影響Western blot檢測結果表明，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1蛋白在HaCaT細胞表面亦呈陽性表達(圖3A)。10、100μg/mL的Mat分別刺激HaCa T細胞24 h后，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1的蛋白表達較正常對照組有不同程度的降低，但差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖3B)。

圖3 Western blot檢測Mat對Th17細胞因子干預后HaCaT細胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1蛋白表達的影響Fig.3 Effects of Mat on the protein expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells treated with Th17 cytokines analyzed by Western blot

IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22 (10 ng/m L)聯(lián)合刺激可使IL-17RA蛋白的表達上調178.7%(P＜0.001)，IL-21R蛋白上調183.1%(P＜0.01)，IL-22R1蛋白上調127.1%(P＜0.05)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。Mat(10μg/m L)及Mat(100μg/m L)分別可以使經(jīng)上述細胞因子刺激后所上調的IL-17RA蛋白顯著下降了191.5%(P＜ 0.01)及255%(P＜0.001)，且呈量效關系；IL-21R蛋白顯著下降242.9%(P＜0.01)及254.7%(P＜0.01)；IL-22R1蛋白顯著下降184.1%(P＜0.05)及193.1%(P＜0.05)；而Mat(100μg/m L)與Th17分泌的3種細胞因子聯(lián)合孵育后，仍可使經(jīng)Th17細胞因子刺激后所上調IL-17RA蛋白的表達下調185.8% (P＜0.01)；IL-21R蛋白的表達下調175.3%(P＜0.01)；IL-22R1蛋白的表達下調105.5%(P＜0.05，圖3)。

3 討 論

Mat是中藥苦參的主要生物堿，具有廣泛的藥理作用。臨床上Mat可用來治療銀屑病等慢性炎癥性皮膚疾?。?］，但其作用機制尚不清楚。近年來，多位學者已證實銀屑病為Th1和Th17所介導的免疫性疾?。?］。我們以前的實驗也發(fā)現(xiàn)IL-17A、IL-21及IL-22及其受體在銀屑病的表皮細胞高表達。銀屑病的組織病理顯示KC角化過度及角化不全。KC細胞為銀屑病最重要的病變細胞。因此，我們通過用Th17分泌的細胞因子IL-17A、IL-21及IL-22單獨及2因子和3因子聯(lián)合干預HaCat細胞，發(fā)現(xiàn)其靶受體的m RNA表達無顯著差異。因此，我們認為Th17效應因子對自身受體存在較強的激活作用，與其他Th17分泌因子聯(lián)合作用不能加強或減弱其對自身受體的激活效應。因此，我們將Th17最主要的3個效應因子聯(lián)合刺激HaCat作為類銀屑病樣細胞模型，并應用Mat進行藥物干預，觀察其作用機制。

本實驗首先發(fā)現(xiàn)，IL-17A、IL-21及IL-22作為Th17最具代表性的因子，可以正向調節(jié)角質形成細胞IL-17RA、IL-21R的基因和蛋白表達增加，同時促進IL-22R1蛋白升高。這可能與炎癥因子正反饋地調節(jié)其受體的表達有關。以往研究表明，IL-17A作為很強的中性粒及單核細胞趨化因子，可能在銀屑病中通過和其受體IL-17RA結合，起到很強的促炎作用［10］。IL-21可以促進T細胞向Th17分化，Th17又可以分泌IL-21，從而起到正反饋作用［11］。在銀屑病小鼠模型，IL-21通過IL-21R作用可誘發(fā)IFN-γ-依賴性銀屑病樣反應，從而證實IL-21維持皮膚炎癥損傷的一種機制［12］。而IL-22則與其受體IL-22R1結合，發(fā)揮其促炎及表皮增生作用［13］。這些均證實3種細胞因子聯(lián)合作用可以從不同機制相互促進銀屑病發(fā)生。

在Mat單獨及聯(lián)合細胞因子干預時，結果發(fā)現(xiàn)Mat單獨刺激可以抑制HaCat細胞上述細胞因子受體的表達，但與正常對照相比，差異無統(tǒng)計學意義，提示Mat對正常角質形成細胞的抗Th17作用不明顯。但是與Th17細胞因子刺激組相比，IL-17RA及IL-21R明顯被抑制，而對IL-22R1抑制作用較弱。而Mat與Th17細胞因子聯(lián)合干預則會削弱這一作用。提示Mat在抑制Th17反應中，對IL-17及IL-21所誘導的抗炎功能更強大，而抑制角質形成細胞IL-22所介導的增殖及促炎功能較小。ZHAO等［14］研究發(fā)現(xiàn)Mat可抑制自身免疫性腦脊髓炎動物模型IL-23/ IL-17軸，從而改善其癥狀。這與本實驗結果一致。因此，推測Mat治療銀屑病等皮膚病可通過抑制Th17而發(fā)揮功效。

Th17所介導的皮膚病發(fā)生機制非常復雜，多種組織細胞及炎癥介質參與其中。本實驗從角質形成細胞的角度，首次探討了Mat對Th17誘導的人KC株HaCaT細胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1的抑制作用。并推測Mat在Th17所誘導的銀屑病等皮膚病中可能直接作用于其抗炎靶點細胞角質形成細胞，抑制其分泌的Th17細胞因子受體，從而發(fā)揮其治療作用。

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(編輯 國 榮)

Matrine inhibits Th17 cytokine-induced IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 expressions of keratinocytes

ZHOU Yan1，MOU Kuan-hou1，HAN Dan1，LI Yue2，HOU Wei-kun3，Ma Ya-mei1，LüShe-min2
(1.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，2.Department of Genetics and Molecular Biology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；3.Department of Bone and Joint Diseases，Xi'an Honghui Hospital，Xi'an 710054，China)

ObjectiveTo investigate the effects of matrine(Mat)on the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 induced by Th17 cytokines in HaCaT of keratinocytes.MethodsWe cultured HaCaT cells and stimulated HaCaT cells with Th17 effector cytokines IL-17A(10 ng/m L)，IL-21(10 ng/m L)and IL-22(10 ng/m L) together to simulate psoriasis-like cell model.The cell model was treated with 10μg/m L and 100μg/m L Mat.RT-qPCR and Western blot were applied to detect the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1.MethodsIL-17RA，IL-21R and IL-22R1 were expressed in HaCaT cells at both m RNA and protein levels.HaCaT cells triggered by IL-17A，IL-21 and IL-22 together could significantly enhance the m RNA and protein expressions of IL-17RA and IL-21R as well as the protein expression of IL-22R1(P＜0.05).Mat treatment on the cells without Th17 cytokine stimulation did not affect IL-17RA，IL-2 1 R or IL-2 2 R 1 expression(P＞0.05)，but Mat treatment to the cellsseparately or with Th17 cytokine stimulation together can significantly inhibit IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 protein expressions compared with Th17 cytokine stimulation group(P＜0.05).ConclusionStimulation of HaCaT cells with IL-17A，IL-21 and IL-22 can enhance the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1.Mat seems to play an anti-inflammatory role through abrogating the stimulatory effects of Th17 cytokines on their receptor expressions in autoimmune skin disease.

matrine；Th17 cytokine；interleukin-17 receptor A；interleukin-21 receptor；interleukin-22 receptor 1

R751

A

1671-8259(2014)05-0695-05

10.7652/jdyxb201405026

2014-04-28

2014-06-12

陜西省社會發(fā)展攻關計劃項目(No.2010K16-04)；國家自然科學基金資助項目(No.81201373) Supported by the Social Development Research Project of Shaanxi Province(No.2010K16-04)and the National Natural Science Foundation of China(No.81201373)

呂社民，教授，博士生導師.E-mail：lushemin@mail.xjtu.edu.cn

周艷(1977-)，女(漢族)，主治醫(yī)師，博士研究生，主要從事免疫相關皮膚病研究.E-mail：yanzhou7798@163.com

時間：2014-07-22 16∶28 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1628.009.html