陳 孜，徐又佳，李光飛，張 鵬，沈光思

(1.蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇蘇州 215004；2.南京大學附屬常州第二醫(yī)院骨科，江蘇常州 213000)

◇技術(shù)方法研究◇

SELEX篩選骨肉瘤HER2適配體方法的建立

陳 孜1，2，徐又佳1，李光飛1，張 鵬1，沈光思1

(1.蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇蘇州 215004；2.南京大學附屬常州第二醫(yī)院骨科，江蘇常州 213000)

目的應(yīng)用SELEX(system evolution of ligands by exponential enrichment)技術(shù)篩選與HER2特異性結(jié)合的寡聚核酸適配體(aptamer)。方法體外合成了長度為78個堿基并含有35個隨機寡核苷酸的ssDNA文庫，通過生物素-鏈親和素磁珠系統(tǒng)分離法制備次級ssDNA文庫，且經(jīng)以微孔為介質(zhì)的SELEX正反篩法獲得了與HER2特異性結(jié)合的DNA適配體；同時利用生物素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測每輪ssDNA與靶蛋白HER2的親和力，將親和力最高的適配體群進行克隆、測序。最后利用生物學軟件DNAMAN對適配體群進行了一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的分析，同時將親和性最高的適配體做了進一步的特異性的檢驗。結(jié)果經(jīng)過12輪的篩選，獲得了與HER2蛋白具有極高親和力的適配體9號，親和力從初始的0.18上升至0.86，提高了約5倍。特異性結(jié)果顯示，9號適配體只與HER2具有較高的特異性。結(jié)論經(jīng)過多輪的篩選，成功獲得了特異性識別骨肉瘤HER2蛋白的單鏈DNA適配體，為骨肉瘤的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。

SELEX技術(shù)；骨肉瘤；HER2；DNA適配體

骨肉瘤是好發(fā)于青少年的骨原發(fā)性惡性腫瘤，5年生存率低，是嚴重影響青壯年健康的惡性腫瘤之一。因此，早期診斷對骨肉瘤的治療及預(yù)后至關(guān)重要。近些年來，由于應(yīng)用保肢手術(shù)、化療、熱療及免疫治療等復(fù)合治療，使得骨肉瘤患者的5年存活率提高到70%左右［1］。盡管如此，仍有30%～40%的患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，這些患者中的大部分對于保肢治療無效、預(yù)后差［2］。如果用一種精確的分子診斷標記物作為一種判斷指標，將對骨肉瘤的早期診斷和預(yù)后都是非常有用的。

HER2是骨肉瘤的分子診斷標記物之一，是由癌基因erbB-2/編碼的分子質(zhì)量為185 ku、且功能類似于一種生長因子受體樣的跨膜糖蛋白，因其能過度傳導生長信號，所以導致細胞惡性增殖［3］。惡性程度越高，越容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且對預(yù)后的判斷就越差。因此，針對HER2的靶向治療在醫(yī)學上有著重大的意義。

目前，在疾病的早期診斷中對分子標記物的方法主要有：PCR、熒光定量、免疫熒光、ELISA等方法來檢測樣品中靶蛋白的存在。近年來，適配體(aptamer)替代抗體已在蛋白質(zhì)檢測上得到廣泛應(yīng)用。適配體是通過SELEX技術(shù)從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選出來的，與非核酸靶物質(zhì)特異結(jié)合的高親和性單鏈寡核苷酸序列。而SELEX技術(shù)是利用分子生物學技術(shù)，將隨機寡核苷酸文庫與靶物質(zhì)相互作用，保留結(jié)合的寡核苷酸序列，經(jīng)反復(fù)擴增、篩選，使與該靶物質(zhì)特異結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集。SELEX技術(shù)已經(jīng)被成功的應(yīng)用于很多領(lǐng)域，但以骨肉瘤HER2為靶分子作為研究對象，尚未見報道。本文旨在用SELEX技術(shù)篩選出與HER2特異性結(jié)合的適配體，為骨肉瘤的早期診斷和預(yù)后判斷提供了一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料HER2重組蛋白(8 mg/m L)由西安晶彩生物科技有限公司提供；ssDNA文庫，引物均參照文獻［4］的方法：中間為35個堿基的隨機序列，兩端為固定序列(5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3')；PCR擴增所用引物由引物軟件Primer5.0設(shè)計，無標記的上游引物(A1)：5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3'，無標記的下游引物(A2)：5'-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'，下游5'標記有生物素(A3)：5'-生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'，均由北京華大基因研究中心合成；鏈親和素磁珠購自Promega公司；異硫氰酸胍購自GIBCO公司；酵母tRNA、BSA、p GM-T克隆試劑盒、HRP-labeled Streptavidin和TMB顯色液均由晶彩生物提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞系及培養(yǎng)體外培養(yǎng)人骨肉瘤細胞系mg-63和人成骨細胞系hFOB1.19(第四軍醫(yī)大學細胞中心)，用DMEM培養(yǎng)基(含100 m L/L的胎牛血清)，在37℃孵育箱中培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 生物素-鏈親素磁珠分離制備次級ssDNA文庫 在PCR的反應(yīng)中，以ssDNA文庫為模板，利用A3引物擴增出3'端帶有生物素的dsDNA文庫，將純化后的dsDNA產(chǎn)物，與鏈親和素磁珠結(jié)合，以生物素為介質(zhì)會將dsDNA與磁珠上的鏈親和素結(jié)合，后用0.15 mol/L的NaOH使dsDNA變性解鏈，用生物素標記的一條鏈與鏈親和素結(jié)合留在磁珠上，而解離下來的是一條不帶生物素的核酸鏈，經(jīng)乙醇沉淀后，溶于TE中，測定吸光值，作為次級ssDNA文庫［］。

1.3.2 利用以微孔為介質(zhì)的篩選方法篩選與HER2蛋白結(jié)合的適配體 參考文獻［6］的方法，用包被液為0.05 mol/L的Na HCO3，p H 9.6的緩沖液將骨肉瘤HER2蛋白包被于96孔酶聯(lián)板上，于4℃過夜，同時以空白孔作為對照組，用0.3 g/L牛血清白蛋白(BSA)封閉液將HER2包被孔和空白孔于37℃封閉2 h。將體外合成的ssDNA文庫在結(jié)合液SHCMK (20 mmol/L Hepes p H 7.35、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2)中與空白對照孔于37℃結(jié)合40～60 min，同時在結(jié)合液中加入酵母t RNA競爭試劑，提高適配體的特異性。利用反篩法除去與BSA和微孔結(jié)合的ssDNA，然后轉(zhuǎn)移到骨肉瘤HER2蛋白包被孔中與HER2蛋白于37℃結(jié)合40～60 min，用洗滌液(含有0.05% SHCMK)洗滌4～6次，除去未結(jié)合的ssDNA，最后加洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl、4 mmol/L異硫氰酸胍、1 mmol/L DTT，p H 8.3)在80℃作用10～15 min，洗脫下與HER2蛋白結(jié)合的ssDNA，經(jīng)苯酚-氯仿法抽提，乙醇沉淀將ssDNA分離出，再以此為模板用A3引物經(jīng)PCR擴增獲得帶有生物素標記的dsDNA文庫，進一步用生物素-鏈親和素磁珠分離ssDNA，作為次級ssDNA文庫。

1.3.3 次級ssDNA文庫親和力的檢測 將純化獲得的ssDNA文庫，采用生物素標記的A3引物擴增獲得5'端標記了生物素的ssDNA文庫。利用以微孔為介質(zhì)的篩選過程設(shè)置空白對照孔和蛋白包被孔，然后加入各輪標記有生物素的ssDNA文庫孵育，然后加入1∶1 000稀釋的HRP-labeled Streptavidin于37℃孵育20～30 min，最后加入TMB顯色液200 μL，室溫避光顯色15 min，加入2 mol/L H2SO4450 μL終止反應(yīng)，5 min內(nèi)于酶標儀中測定A450nm。

1.3.4 篩選產(chǎn)物的克隆、測序、分析 利用對稱PCR的方法將篩選克隆到的ssDNA產(chǎn)物擴增成無標記的dsDNA，將其純化后TA克隆到p GM-T載體上，轉(zhuǎn)化后任意挑取25個克隆進行菌落PCR的鑒定，將鑒定成功的陽性菌液送華大基因研究中心進行測序，利用生物軟件DNAMAN對測序后的結(jié)果進行一級和二級結(jié)構(gòu)分析。

1.3.5 適配體親和力的檢測 隨意提取適配體群中8個含有相應(yīng)適配體序列的質(zhì)粒，以此為模板，采用生物素標記的A3引物分別擴增獲得8個5'端標記了生物素的適配體ssDNA序列。按第1.3.3節(jié)親和力檢測的方法測定各適配體的A450nm值。

1.3.6 適配體特異性的檢測 按照1.3.3的方法來檢測親和性最高的適配體與骨肉瘤細胞中HER2蛋白的特異性，實驗重復(fù)3次且分為以下5組：適配體9號分別與正常細胞、骨肉瘤細胞、牛血清白蛋白、脫脂奶粉進行結(jié)合反應(yīng)測定其特異性，其中空白對照只加適配體，不加其他任何物質(zhì)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增條件的優(yōu)化在PCR擴增反應(yīng)中，為了提高DNA的純度和產(chǎn)量，對其退火溫度和循環(huán)次數(shù)都進行了摸索，經(jīng)10 g/L的瓊脂糖電泳檢測。結(jié)果顯示，退火溫度為60℃時，其條帶較亮且特異性較好(圖1)。當退火溫度一定時，分別進行了12、16、20、24、30、40個循環(huán)的PCR，經(jīng)濃度為100 g/L SDSPAGE電泳分析，結(jié)果顯示，PCR為24個循環(huán)時可以擴增到相對大量且特異的ssDNA，隨著循環(huán)數(shù)的增加，引物濃度不斷的降低，從第30個循環(huán)之后條帶出現(xiàn)了彌散狀態(tài)，非特異性增多(圖2)。

圖1 PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化Fig.1 The dsDNA products by PCR at different annealing temperature

2.2 各輪次級文庫ssDNA親和力的檢測經(jīng)SELEX技術(shù)的反復(fù)篩選，利用生物素-辣根過氧化物酶-鏈霉親和素系統(tǒng)檢測每各輪次級文庫ssDNA文庫與HER2多肽的親和力。結(jié)果顯示，親和力在第12輪明顯提高，之后親和力趨于一個水平狀態(tài)，因此在第14輪停止檢測(圖3)。

圖2 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的優(yōu)化電泳圖Fig.2 The dsDNA products by PCR at different cycles

圖3 各輪次級文庫ssDNA親和力的檢測Fig.3 Determination of the affinities of secondary libraries for HER2 using a biotin-strepavidin-HRP detecting system

2.3 適配體一級結(jié)構(gòu)的分析將第12輪篩選的ss-DNA文庫，克隆至載體PGM-T中，共挑選了25個克隆子進行測序，并對其測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行了比對分析，結(jié)果顯示25個適配體并無共同的保守序列(表1)。

2.4 適配體二級結(jié)構(gòu)的分析用生物學軟件DNAMAN模擬了適配體的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，適配體主要由A、B、C、D四種結(jié)構(gòu)形式存在，這與其具有較高的親和性的特征是相符的。

2.5 適配體親和力的檢測從4組不同的二級結(jié)構(gòu)中選取了8個適配體進行親和力的檢測，發(fā)現(xiàn)第2組中的9號適配體與骨肉瘤HER2蛋白親和力最高(圖4)。

2.6 測定9號適配體的特異性數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析適配體與每組樣品間的特異性。結(jié)果顯示，9號適配體與骨肉瘤細胞的特異性顯著，與正常細胞、牛血清白蛋白、脫脂奶粉的結(jié)合值及空白對照組比較無顯著特異性(圖5)。

表1 25個適配體的測序結(jié)果Tab.1 Sequencing Results of 25 aptamers

圖4 8個適配體的親和力測試結(jié)果Fig.4 Determination of the affinities of 8 aptamers for HER2 using a biotin-strepavidin-HRP detecting system

圖5 9號適配體特異性檢測結(jié)果Fig.5 Specificity of aptamer number 9

3 討 論

SELEX篩選技術(shù)是一種從大容量的單鏈寡聚核苷酸庫中篩選與靶蛋白高特異結(jié)合的寡聚核苷序列。由于適配體在功能上與抗體相似，且又具有比抗體優(yōu)越的特性：穩(wěn)定性好、可被修飾、獲得周期短、且與靶蛋白特異性結(jié)合。適配體能夠分辨出靶物質(zhì)結(jié)構(gòu)上細微的差別，甚至對一個甲基或是一個羥甲基的區(qū)別都能夠辨認［7］。所以，適配體篩選技術(shù)在骨肉瘤的早期診斷和預(yù)后判斷中已經(jīng)越來越受到人們的青睞。在多種腫瘤組織中都存在HER2/neu基因的擴增和過表達(over express)，包括20%～30%卵巢和乳腺癌、35%～45%胰腺癌及90%的結(jié)腸直腸癌［8］、40%～44%成骨肉瘤及58%成骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移癌［9-10］、16%～57%的非小細胞肺癌［11］，已經(jīng)成為一種公認的腫瘤標志物。

本研究以大分子骨肉瘤HER2蛋白為靶蛋白，篩選與之特異性結(jié)合的適配體。為提高篩選的有效性，本文從退火溫度和循環(huán)數(shù)兩個方面進行篩選條件的優(yōu)化，得到了大量特異的次級ssDNA文庫，同時為獲得純度較高的dsDNA，本文采用生物素-鏈親和素磁珠分離法。在操作過程中只需保證dsDNA的量的純度，便可獲得極高純度和足量的ssDNA。在篩選過程中靶分子和寡聚核苷酸文庫濃度的比值對篩選效率有著很大的影響，對其比值進行優(yōu)化，隨著篩選輪數(shù)的增加，次級文庫的ssDNA的量和親和性會得到富集，這與實驗中檢測的親和性提高了約5倍是相符合的。

DNAMAN軟件模擬適配體的二級結(jié)構(gòu)顯示，其主要是以口袋和莖環(huán)的形式存在，這可能是適配體與HER2蛋白結(jié)合的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。SPSS統(tǒng)計軟件分析了9號適配體與骨肉瘤細胞的特異性顯著(P＜0.05)，而對照組幾乎不存在特異性。因此，可以作為一種重要的靶向分子應(yīng)用于骨肉瘤的診斷和治療中。本文篩選出的骨肉瘤HER2蛋白的適配體，為骨肉瘤早期的診斷和預(yù)后判斷提供了一種新的方法，這在靶向治療方面具有著很重要的應(yīng)用潛能。

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(編輯 卓選鵬)

Establishment of screening osteosarcoma HER2 aptamer method by SELEX

CHEN Zi1，2，XU You-jia1，LI Guang-fei1，ZHANG Peng1，SHEN Guang-si1
(1.Department of Orthopedics，the Second Affiliated Hospital of SooChow University，Suzhou 215004；2.Department of Orthopedics，Changzhou No.2 Hospital of Nanjing University，Changzhou 213000，China)

ObjectiveTo screen oligo-nucleic acid aptamers with HER2-specific binding by system evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)technology.MethodsWe in vitro synthesized with a length of 78 bases containing 35 random nucleotides ssDNA library and prepared secondary separation system ssDNA library by biotin-streptavidin beads.The microporous was used as a medium to obtain with HER2-specific binding of DNA aptamers by SELEX.We detected the affinity of each round of ssDNA with the target protein HER2 using biotinstreptavidin-biotin-horseradish peroxidase system.The highest affinity aptamers group was cloned and sequenced. Finally，we analyzed the primary and the secondary structures of the aptamers group using biological software DNAMAN，and meanwhile further tested the specificity of the aptamer with the highest affinity.ResultsAfter 12 rounds of screening，we obtained aptamers that had high affinity with HER2 protein and the number was 9；the affinity increased by about 5 times from the initial 0.18 to 0.86.Specificity Results showed that number 9 aptamer had a high specificity only with HER2.ConclusionAfter several rounds of screening，we successfully obtained osteosarcoma HER2 protein specifically recognizing single-stranded DNA aptamers，which has laid a solid foundation for the diagnosis and treatment of osteosarcoma.

SELEX technology；osteosarcoma；HER2；DNA aptamer

R446.6

A

1671-8259(2014)05-0703-04

10.7652/jdyxb201405028

2013-09-10

2013-12-25

國家自然科學基金資助項目(No.81273090) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81273090)

徐又佳，教授，博士，碩士生導師.E-mail：xuyoujia@medmail.com.cn

陳孜(1972-)，男(漢族)，碩士研究生，主要從事骨腫瘤治療.E-mail：coolcz2000@gmail.com

時間：2014-05-16 16∶06 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140524.2118.005.html