劉友平，劉 田，畢 航，張 磊，黨永輝

(1.西安交通大學(xué)宗濂書院，2.西安交通大學(xué)啟德書院，3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061)

品系、性別和生物節(jié)律對小鼠曠場實驗的影響

劉友平1，劉 田2，畢 航2，張 磊1，黨永輝3

(1.西安交通大學(xué)宗濂書院，2.西安交通大學(xué)啟德書院，3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061)

目的探討性別、品系以及晝夜生物節(jié)律對曠場實驗的影響。方法利用曠場實驗檢測不同性別的C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠在白天與夜間對新環(huán)境的探索行為與自發(fā)活動能力。結(jié)果3種品系小鼠曠場實驗結(jié)果顯示：C57BL/6在曠場中探索活動和自發(fā)活動量最低，顯著低于BALB/c和昆明小鼠；C57BL/6雌、雄小鼠在白天和夜晚探索活動和自發(fā)活動量未見差異，而BALB/c和昆明小鼠分別在白天和夜間呈現(xiàn)性別差異；C57BL/6雌雄小鼠晝夜探索活動和自發(fā)活動量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而BALB/c和昆明雌性小鼠呈現(xiàn)夜間高于白天，雄性小鼠則無此表現(xiàn)。結(jié)論C57BL/6小鼠在新環(huán)境中探索活動少，自發(fā)活動量低，且受性別、節(jié)律因素影響較小，適合用于神經(jīng)行為學(xué)和焦慮相關(guān)行為研究。

曠場實驗；探索行為；自發(fā)活動；品系；性別；生物節(jié)律；神經(jīng)行為學(xué)；BALB/c小鼠；C57BL/6小鼠；昆明小鼠

小鼠(Mus musculus)是廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生理心理學(xué)和神經(jīng)精神藥物學(xué)等研究領(lǐng)域的實驗動物之一［1］，根據(jù)其基因純合程度?？煞譃榻幌?inbred strain)和封閉群(closed colony)兩類［2］。按照我國《實驗動物哺乳類實驗動物的遺傳質(zhì)量控制》標(biāo)準(zhǔn)，近交系小鼠是指連續(xù)20代以上的全同胞兄妹或親子交配培育而成，品系內(nèi)所有個體都可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對共同祖先的遺傳群；封閉群小鼠則是指以非近親交配方式進行繁殖生產(chǎn)的一個實驗動物種群，在不從外部引入新個體的條件下，至少連續(xù)繁殖4代以上的群體［2-3］。近交系常見品系有C57BL/6、BALB/c等，封閉群常見有昆明、ICR等品系小鼠［2］。

曠場實驗(open field test，OFT)，也稱敞箱實驗、空場實驗，是評價嚙齒類實驗動物運動功能［4］和焦慮狀態(tài)［5］的經(jīng)典行為學(xué)方法，被廣泛運用于精神神經(jīng)藥理學(xué)、神經(jīng)行為學(xué)等的基礎(chǔ)研究［5-6］。其原理基于嚙齒類動物同時有畏懼空曠場地和探究新事物、新環(huán)境的天性［7］，因此在一個開闊的場地中其活動呈現(xiàn)趨避性(phobotaxis)［8］。一般認(rèn)為在實驗動物沒有事先熟悉敞箱的情況下，記錄到的曠場活動前10～20 min以探究活動為主，后30～40 min主要反映自發(fā)活動［9］。曠場實驗受到諸多因素的影響，諸如動物遺傳變異［10］、性別、實驗環(huán)境［11］、晝夜節(jié)律、動情周期等［12］。

為研究曠場實驗主要指標(biāo)所受實驗條件的影響，本文通過研究不同性別、不同品系(昆明、C57BL/6和BALB/c)小鼠在不同測試時間(早、晚)曠場活動中的表現(xiàn)，深入探討品系、性別和生物節(jié)律對小鼠曠場實驗的影響。

1 材料與方法

1.1 動物昆明、C57BL/6、BALB/c小鼠各32只，雌雄各半，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗已獲西安交通大學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)，并按動物實驗管理條例進行小鼠飼養(yǎng)和管理。同品系同性別小鼠每4只隨機同籠飼養(yǎng)。小鼠按性別、品系分別進行隨機分組，每8只分為1組，以K、C、B分別代表昆明、C57BL/6、BALB/c各品系，F(xiàn)、M代表雌、雄，D、N代表白天、夜間，共分為KFD、KFN、KMD、KMN、CFD、CFN、CMD、CMN、BFD、BFN、BMD、BMN共12組(n=8)，各組間小鼠體質(zhì)量經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗未見差異。飼養(yǎng)條件：室溫(23±1)℃；濕度(50 ±5)%；日光燈采光，光暗周期12/12(光照時間為7∶00～19∶00)；動物自由獲取水和食物。

1.2 儀器設(shè)置采用計算機實時監(jiān)測分析系統(tǒng)SMART VIDEO-TRACKING(美國、SMARTv3.0.02)。該儀器主要由4個40 cm×40 cm×40 cm實驗敞箱組成，箱子頂部中央安置有與記錄系統(tǒng)相連接的攝像機，通過系統(tǒng)分析小鼠實時圖像以獲得小鼠在曠場中的行為數(shù)據(jù)。

1.3 OFT實驗實驗前將各品系小鼠在飼養(yǎng)室適應(yīng)1周，在此期間每天抓摸動物5 min左右使其適應(yīng)實驗者的操作。實驗開始前30 min將小鼠移入測試室適應(yīng)，以保證實驗時小鼠活動趨于穩(wěn)定。測試時間：白天為8∶30～11∶30，夜間為20∶30～23∶30。實驗前選擇SMART系統(tǒng)中的曠場模式并進行模式指標(biāo)設(shè)定，將記錄時間設(shè)置為1 h，調(diào)節(jié)亮度等參數(shù)，將小鼠背對操作者放入曠場中央，鍵入“開始”命令后開始進行實驗記錄。每只動物實驗結(jié)束后清除敞箱底板糞便，用500 m L/L乙醇噴灑敞箱底部并用潔凈紗布抹干，以避免前次實驗動物的殘留氣味影響本次實驗。

實驗結(jié)束獲得實驗軌跡數(shù)據(jù)后，利用SMART系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行分析，獲得1 h內(nèi)的每10 min路程距離、總路程距離、前10 min進入中央?yún)^(qū)域次數(shù)等數(shù)據(jù)。以前10 min實驗反映小鼠對新環(huán)境的探索活動，后40 min反映小鼠自發(fā)活動。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進行處理和分析，各組結(jié)果比較采用單因素方差分析并進一步做兩兩比較(LSD法)，分析品系、性別、節(jié)律對曠場實驗結(jié)果指標(biāo)的影響采用三因素析因?qū)嶒灧讲罘治觥?shù)據(jù)均以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 品系因素對小鼠曠場實驗的影響3種品系雌性小鼠前10 min探索活動中，白天的測試結(jié)果未見明顯差異，而夜間則顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義：C57BL/ 6、BALB/c、KM探索活動依次遞增(P(CFN；BFN)= 0.018，P(CFN；KFN)＜0.001，P(BFN；KFN)=0.001)；雄性小鼠則不論白天夜間，BALB/c、KM都顯著高于C57BL/6小鼠(P(CMD；BMD)=0.001，P(CMD；KMD)= 0.006；P(CMN；BMN)=0.026，P(CMN；KMN)=0.041，圖1A)。

3種品系雌性小鼠后40 min自發(fā)活動的測試結(jié)果：在白天，盡管C57BL/6、BALB/c之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但3者在數(shù)值上呈遞增趨勢(其中P(CFD；KFD)=0.006)；在夜間，C57BL/6、BALB/c、KM之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，依次遞增(P(CFN；BFN)=0.001，P(CFN；KFN)＜0.001，P(BFN；KFN)=0.001)。3種品系雄性小鼠在白天BALB/c、KM結(jié)果高于C57BL/6，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P(CMD；BMD)＜0.001，P(CMD；KMD)= 0.001)，在夜間BALB/c活動量依然最高，C57BL/6、KM間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P(CMN；BMN)＜0.001，P(BMN；KMN)=0.011，圖1B)。

2.2 性別因素對3種品系小鼠曠場實驗的影響3種品系小鼠白天前10 min測試結(jié)果中，BALB/c活動量雄性高于雌性(P(BFD；BMD)=0.006)，C57BL/6和昆明雌雄小鼠則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；夜間測試結(jié)果顯示KM雌性小鼠活動量顯著高于雄性(P(KFN；KMN)＜0.001)，C57BL/6和BALB/c雌性和雄性活動量未見差異(圖2A)。后40 min結(jié)果與前10 min一致(P(BFD；BMD)=0.011，P(KFN；KMN)＜0.001，圖2B)。

圖1 不同品系小鼠在曠場中探索活動和自發(fā)活動結(jié)果Fig.1 Effects of strain on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

圖2 不同性別小鼠在曠場中探索活動和自發(fā)活動結(jié)果Fig.2 Effects of sex on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

2.3 生物節(jié)律因素對3個品系小鼠曠場實驗的影響3種品系雄性小鼠在前10 min不同測試時間測試結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；雌性小鼠則只有C57BL/6晝夜結(jié)果未見差異，BALB/c和昆明小鼠均表現(xiàn)夜間活動多于白天(P(BFD；BFN)=0.013，P(KFD；KFN)＜0.001，圖3A)。后40 min，結(jié)果與前10 min一致(P(BFD；BFN)=0.008，P(KFD；KFN)＜0.001，圖3B)。

圖3 不同節(jié)律條件下小鼠在曠場中探索活動和自發(fā)活動結(jié)果Fig.3 Effects of circadian rhythm on mice exploratory behavior and spontaneous activities in OFT(n=8)

2.4 品系、性別、節(jié)律對小鼠曠場實驗結(jié)果影響的三因素析因分析結(jié)果對探索活動的析因方差分析結(jié)果表明品系、節(jié)律對小鼠曠場實驗中探索活動有影響；品系與性別、性別與節(jié)律的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(P(品系*性別)=0.012，P(性別*節(jié)律)=0.016)；品系、性別與節(jié)律的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(P(品系*性別*節(jié)律)= 0.013)。通過比較不同組合下的均值可以得出：3種品系中，C57BL/6小鼠探索活動均低于BALB/c和昆明小鼠，其中，雄性C57BL/6小鼠在白天探索活動最少。

對自發(fā)活動的析因方差分析結(jié)果表明品系、性別、節(jié)律對小鼠曠場實驗中自發(fā)活動有影響；品系與性別、性別與節(jié)律的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(P(品系*性別)＜0.001，P(性別*節(jié)律)＜0.001)；品系、性別與節(jié)律的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(P(品系*性別*節(jié)律)= 0.005)。比較不同組合下自發(fā)活動均值可得出：C57BL/6自發(fā)活動顯著少于BALB/c和昆明小鼠，其中雄性C57BL/6小鼠在白天自發(fā)活動最少(表1)。

表1 各組小鼠曠場探索活動和自發(fā)活動路程結(jié)果Tab.1 Results of exploratory behavior and spontaneous activities of each group in OFT()

表1 各組小鼠曠場探索活動和自發(fā)活動路程結(jié)果Tab.1 Results of exploratory behavior and spontaneous activities of each group in OFT()

前10 min路程反映小鼠對新環(huán)境的探索活動，后40 min路程反映小鼠自發(fā)活動。

品系性別節(jié)律前10 min路程(cm)后40 min路程(cm) C57BL/6雌性(F)白天(D)3 913.09±635.81 9 704.39±1 047.01夜間(N)3 857.01±384.75 9 875.58±932.02雄性(M)白天(D)3 510.14±1 194.35 8 515.29±1 076.94夜間(N)4 009.83±703.69 9 474.95±1 659.52 BALB/c雌性(F)白天(D)3 804.20±708.66 12 446.81±2 826.60夜間(N)4 906.87±567.83 17 339.89±3 575.37雄性(M)白天(D)4 984.51±1 179.64 17 001.08±4 590.25夜間(N)4 968.26±808.78 16 196.60±2 995.43 KM 4 715.58±702.49 11 647.49±2 559.60雌性(F)白天(D)4 490.78±890.69 14 833.01±6 256.62夜間(N)6 434.80±1 192.56 23 378.96±6 191.70雄性(M)白天(D)4 802.79±478.69 14 352.77±1 378.84夜間(N)

3 討 論

本實驗通過不同性別的C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠在不同時間點(晝夜生物節(jié)律期不同)條件下進行1h曠場實驗測試，分析其探索行為與自發(fā)活動。曠場實驗是一種通過檢測動物自主活動(locomotor activity)研究動物行為的實驗方法［13］。曠場實驗的設(shè)計原理是基于嚙齒類動物的趨觸性(thigmotaxis)，指的是小鼠畏懼開闊、未知、可能存在潛在危險的場所，因而表現(xiàn)出“貼墻”活動［14］的特性。一般認(rèn)為，曠場實驗中小鼠的水平活動(ambulation)反映動物的運動活性，垂直運動(rearing)反映動物對新鮮環(huán)境的好奇程度［13］，糞便顆數(shù)反映動物在新環(huán)境中的緊張狀態(tài)［5，15］。在未適應(yīng)敞箱情況下，前10～20 min反映小鼠的探索活動，20～60 min反映小鼠自發(fā)活動［9］，60 min后小鼠活動減少，活動趨于穩(wěn)定，小鼠表現(xiàn)出較明顯的晝夜活動特點［16］。在人類漫長的培育過程中，實驗小鼠已分化為多個品系如Swiss、ICR、BALB/c、C57BL/6等。其中，C57BL/6和BALB/c小鼠是科學(xué)研究中常用但遺傳背景差異較大的兩個近交系，而昆明小鼠一直是我國特有的并且使用量最大的封閉群小鼠［17-18］。以往研究表明，近交系小鼠與封閉群小鼠在基礎(chǔ)活動、學(xué)習(xí)能力以及對危險的反應(yīng)等方面相對存在較大差異［19］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠無論是對新環(huán)境的探索行為還是自發(fā)活動量均顯著低于昆明小鼠，而與BALB/c相比，除雌性小鼠在白天探索活動、自發(fā)活動無差異外，其他情況下均顯著更低，似乎在面對新環(huán)境時存在更明顯焦慮樣行為，此結(jié)果也在相關(guān)研究得到印證［17］。而因處于焦慮狀態(tài)的動物前10～20 min的活動記錄低，給予動物抗焦慮藥物后這段時間的運動會相應(yīng)增高［9］，由此結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，為獲取更準(zhǔn)確、更穩(wěn)定的結(jié)果，在為焦慮相關(guān)疾病及其相關(guān)神經(jīng)行為實驗選擇實驗動物時，應(yīng)優(yōu)先考慮C57BL/6小鼠。

性別因素對小鼠曠場實驗的影響主要體現(xiàn)在自發(fā)活動上，探索活動受性別的影響則不明顯。這可能是因為雌雄本身生理差別而使得小鼠自發(fā)活動量受性別因素影響較大，對新環(huán)境的探索及其焦慮狀態(tài)則與性別差異不大。本實驗發(fā)現(xiàn)，C57BL/6雌雄小鼠在白天與夜間所測探索與自發(fā)活動均未見明顯差異，BALB/c雄鼠在白天曠場活動顯著高于雌鼠，夜間則未見明顯差異，而昆明小鼠則是雌鼠在夜間自發(fā)活動高于雄鼠，白天未見差異。據(jù)此，我們認(rèn)為C57BL/6小鼠可能比較適用于需去除或淡化性別因素的實驗中。

在同等條件下，C57BL/6小鼠曠場結(jié)果不因晝夜節(jié)律而產(chǎn)生差異，而昆明和BALB/c卻只有雄性小鼠在白天和黑夜的探索行為及自發(fā)活動量上未見明顯差異，雌性小鼠在探索行為和自發(fā)活動量上則均表現(xiàn)為夜間比白天高。昆明和BALB/c雌性小鼠在晝夜節(jié)律上表現(xiàn)出差異，可能是由于雌鼠相比雄鼠而言更易受性激素影響從而對晝夜節(jié)律作用的本實驗產(chǎn)生干擾，而雌性C57BL/6受此影響則較小。根據(jù)研究報道，C57BL/6雄性小鼠在上午與下午的曠場測試中差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義［20］，可見C57BL/6雄性小鼠在一天多個時間段的活動均較穩(wěn)定。故本研究結(jié)果提示，在實驗不好控制晝夜節(jié)律因素時，為獲取較可靠結(jié)果，實驗動物可選擇C57BL/6小鼠。

綜上所述，在本實驗中近交系C57BL/6小鼠對新環(huán)境的探索活動少，自發(fā)活動量低，在不同性別、晝夜節(jié)律條件下表現(xiàn)比較穩(wěn)定，可見C57BL/6小鼠是可用于神經(jīng)行為學(xué)研究的“黃金品系”［21］。

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(編輯 國 榮)

Effects of strain，sex and circadian rhythm on open field test on mice

LIU You-ping1，LIU Tian2，BI Hang2，ZHANG Lei1，DANG Yong-hui3
(1.Zong Lian College，2.Qi De College，3.College of Medicine&Forensics of Health Science Center，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the effects of sex，strain and circadian rhythm on open field test(OFT).MethodsBy using OFT，we analyzed exploratory behavior and spontaneous activities of male and female Kunming BALB/c and C57BL/6 mice in new surroundings in the day time or at night.Results①The exploratory behavior and spontaneous activities of C57BL/6 mice were significantly fewer than those of Kunming and BALB/c mice.②The exploratory behavior and spontaneous activities of male and female Kunming and BALB/c mice in the day time presented significant differences compared with those at night.③The exploratory behavior and spontaneous activities of female Kunming and BALB/c mice were significantly more at night than in the day time.ConclusionC57BL/6 mice had fewer exploratory behavior and lower spontaneous activities in novel surroundings.And sex or circadian rhythm had relatively small effects on OFT in C57BL/6 mice.C57BL/6 mice are suitable for research on neuroethology and anxiety disorders.

open field test；exploratory behavior；spontaneous activity；strain；sex；circadian rhythm；neuroethology；BALB/c mice；C57BL/6 mice；Kunming mice

R338

A

1671-8259(2014)05-0634-05

10.7652/jdyxb201405013

2013-10-10

2014-01-01

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81171262，81371473)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練基金項目(No.201310698072) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171262，81371473)and the National Innovation Training Program for University Students(No.201310698072)

黨永輝，副教授.E-mail：psydyh@mail.xjtu.edu.cn

劉友平(1993-)，男(漢族)，本科在讀.E-mail：jiangxiyouyou@stu.xjtu.edu.cn

時間：2014-07-22 16∶19 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1619.005.html