韓海斌，楊建立，丁 玉，溫子玉

(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070;2天津市精神衛(wèi)生中心)

精神分裂癥是一種常見的病因尚未完全闡明的精神病，其發(fā)生可能與神經(jīng)發(fā)育異常有關(guān)［1～3］。目前認(rèn)為，遺傳因素和某些神經(jīng)發(fā)育危險(xiǎn)因素的相互作用，使胚胎期大腦發(fā)育過程出現(xiàn)某種神經(jīng)病理變化，是精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育異常的機(jī)制之一。PAX6作為PAX基因家族中的一員，定位于人染色體第11號(hào)染色體長(zhǎng)臂13位點(diǎn)(11p13)。大腦皮層發(fā)育期間PAX6缺陷導(dǎo)致成熟期認(rèn)知缺陷，發(fā)育階段PAX6缺失導(dǎo)致皮層、皮層間及皮層內(nèi)連接嚴(yán)重缺損，這可能成為鼠及人類出生后認(rèn)知缺損的基礎(chǔ)［4］。相關(guān)研究表明，PAX6基因多態(tài)性可能通過調(diào)節(jié)發(fā)育中或成年的大腦而參與偏執(zhí)型精神分裂癥的發(fā)生［5］。本研究采用病例對(duì)照研究方法，探討PAX6基因多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者組:2011～2013年在天津市精神衛(wèi)生中心治療的首發(fā)精神分裂癥患者270例，均為漢族，年齡18～45歲。診斷由2名以上精神科主治醫(yī)師獨(dú)立完成，符合DSM-IV關(guān)于精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除煙酒及其他精神活性物質(zhì)濫用者、有其他精神障礙家族史者、有肝腎嚴(yán)重軀體疾病者?；颊呷虢M前詳細(xì)了解本研究目的和程序，并簽署知情同意書。對(duì)照組:健康志愿者320例，均為漢族，年齡、性別與患者組具有可比性;一般健康問卷各項(xiàng)目總分＜30分;經(jīng)非結(jié)構(gòu)式臨床訪談排除精神疾病，且家族中無精神疾病和自殺者，個(gè)體間無血緣關(guān)系;在詳細(xì)了解本研究目的和程序后，均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理 以EDTA作為抗凝劑，取肘靜脈血10 mL充分抗凝處理，冷藏保存，離心后－80℃冷凍。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測(cè) 單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn):通過HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)檢索PAX6基因34 kb區(qū)域(覆蓋上游8 kb和下游4 kb)，選取其中位于PAX6 的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)的 rs3026401、rs1506兩個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)。采用連接酶檢測(cè)反應(yīng)研究SNP的多態(tài)性。

采用AXYGEN公司的AxyPrep-96全血基因組DNA試劑盒提取人類基因組DNA。檢測(cè)總DNA濃度、純度、完整性，擴(kuò)增 SNP位點(diǎn)所在片段，準(zhǔn)備PCR Master Mix(20 μL體系)。反應(yīng)條件:95℃變性15 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min(35個(gè)循環(huán))，72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE中電泳。剩余樣品保存于－20℃。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積ddH2O稀釋，作為連接反應(yīng)的模板。連接反應(yīng)體系(10 μL):在 1.5 mL eppendorf離心管中分別加入 100 μL buffer(10 × )、100 μL Probe Mix、5 μL 連接酶、695 μL去離子水。充分混勻后離心，再取9 μL分裝在200 μL的 PCR反應(yīng)管中，最后再加入1 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物。在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上設(shè)置如下程序:95℃變性2 min，94℃ 30 s、50 ℃ 2 min(35 個(gè)循環(huán))。取1 μL LDR 連接產(chǎn)物、1 μL ABI GS-500 ROX熒光標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)、1 μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2 min，冰中驟冷;于5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中3 000 V電泳2.5 h，應(yīng)用Genescantm672軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、遷移片段大小測(cè)量和校正內(nèi)在分子量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和基因分型。

1.2.3 臨床癥狀評(píng)分比較 治療前采用陽性與陰性癥狀量表(PANSS)評(píng)定陽性癥狀、陰性癥狀及一般精神病理因子情況，對(duì)患者組SNP rs3026401不同基因型患者的臨床癥狀評(píng)分進(jìn)行比較。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間基因型和等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，rs3026401各基因型PASS評(píng)分比較采用方差分析;使用 SHEsis遺傳分析軟件［6］進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡、連鎖不平衡(LD)檢驗(yàn)及單位點(diǎn)和單體型遺傳關(guān)聯(lián)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本情況 因?yàn)闄z測(cè)過程中樣本損失，患者組8例、對(duì)照組2例的rs3026401和(或)rs1506位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失，故在統(tǒng)計(jì)中將其剔除。最終患者組262例、對(duì)照組318例納入本研究。

2.2 基因型及等位基因分析結(jié)果

2.2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果 兩組的SNP rs3026401基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，χ2=0.42、0.37，P 均 ＞0.05;SNP rs1506 基因分布也均符合 Hardy-Weinberg平衡定律，χ2=2.20、0.08，P 均 ＞0.05;表明研究樣本具有群體代表性。

2.2.2 Genemapper數(shù)據(jù)分析結(jié)果 患者組各位點(diǎn)的分型截圖見圖1。

2.2.3 兩組 PAX6 SNP rs1506、rs3026401 基因型、等位基因分布情況 患者組SNP rs1506基因型、等位基因分布與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.877、1.187，P 均 ＞0.05);患者組 SNP rs3026401 基因型、等位基因分布與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.635、11.044，P 均 ＜0.05)。見表1、2。

2.2.4 SNP rs1506、rs3026401的LD 分析結(jié)果 分析結(jié)果顯示，D'=1、r2=0.812，表明這兩個(gè)位點(diǎn)之間存在很強(qiáng)的LD。對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示患者組和對(duì)照組之間單倍型rs3026401A/rs1506T、rs3026401G/rs1506T 頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

圖1 Genemapper數(shù)據(jù)分析患者組各位點(diǎn)的分型截圖

表1 兩組SNP rs1506基因型、等位基因分布［例(%)］

表2 兩組SNP rs3026401基因型、等位基因分布［例(%)］

2.2.5 患者組SNP rs3026401不同基因型患者的臨床癥狀評(píng)分比較 患者組SNP rs3026401不同基因型的陽性癥狀評(píng)分、一般精神病理因子評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，而陰性癥狀評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，即 GG＞AA、GG＞AG(P均 ＜0.05)。見表3。

表3 患者組SNP rs3026401不同基因型患者的PANSS 評(píng)分比較(±s)

表3 患者組SNP rs3026401不同基因型患者的PANSS 評(píng)分比較(±s)

SNP rs3026401基因型PANSS評(píng)分(分)陽性癥狀 陰性癥狀 一般精神病理因子AA 21.25±3.71 22.88±3.91 40.13±5.46 AG 21.33±4.29 23.38±4.60 41.38±5.34 GG 20.58±3.67 25.03±4.21 41.02±4.24 F 0.907 4.738 1.126 P 0.405 0.010 0.326

3 討論

精神分裂癥多起病于青壯年，常緩慢起病，病程遷延，有慢性化傾向和衰退的可能。國(guó)內(nèi)外相繼進(jìn)行的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查顯示，精神分裂癥患病率為1.4‰ ～4.6‰，發(fā)病率為0.16‰ ～0.43‰［7］。精神分裂癥的病因至今尚未明確，現(xiàn)有治療方法效果均不理想［8］。

人與鼠的PAX6基因具有高度同源性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，PAX6基因在發(fā)育過程中的腦和成體腦中都有表達(dá)，且對(duì)腦發(fā)育和腦結(jié)構(gòu)有重要作用［9，10］。此外，有研究表明PAX6參與出生后海馬神經(jīng)發(fā)生的祖細(xì)胞的形成和維持［11］，而海馬的發(fā)生又與精神分裂癥關(guān)系密切［12］。動(dòng)物學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，PAX6抑制鼠類星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)其成熟［13］;PAX6雜合鼠(PAX6－/+)表現(xiàn)出沒有松果體及單邊多小腦回等［14］。有研究表明，PAX6基因突變能夠引起人腦結(jié)構(gòu)異常［15］。精神分裂癥的神經(jīng)發(fā)育異常假說認(rèn)為，由于遺傳因素和某些神經(jīng)發(fā)育危險(xiǎn)因素的相互作用，在胚胎期大腦發(fā)育過程就出現(xiàn)了某種神經(jīng)病理變化。研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者海馬、額皮層、扣帶回和內(nèi)嗅皮層有細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，在這些變化中不伴有膠質(zhì)細(xì)胞增生，可能是由腦發(fā)育階段神經(jīng)元移行異位或分化障礙造成的，破壞了皮層聯(lián)絡(luò)的正常模式［16］。近1個(gè)世紀(jì)以來，大量的關(guān)于精神分裂癥的家系調(diào)查［17］、雙生子研究［18］、寄養(yǎng)子研究［19］、遺傳流行病學(xué)研究等結(jié)果強(qiáng)烈提示，精神分裂癥與遺傳因素密切相關(guān)?，F(xiàn)有研究顯示，精神分裂癥并不遵循孟德爾遺傳規(guī)律，它更可能是一類由多個(gè)、有較小影響和外顯率、相互作用的潛在基因共同作用的結(jié)果。由此可見，尋找并定位與精神分裂癥發(fā)病有較大關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)非常重要。很多研究者致力于尋找與精神分裂癥相關(guān)聯(lián)的基因多態(tài)性的研究，諸如代謝型谷氨酸受體-3基因［20］、精神分裂癥斷裂基因1(DISC1)［21］等的研究。

前脈沖抑制模型(PPI)是研究精神分裂癥的一個(gè)重要模型。有關(guān)研究顯示，PAX6雜合鼠的PPI明顯受損，同時(shí)伴有出生后的神經(jīng)發(fā)育異常［22］。大腦皮層發(fā)育期間PAX6缺陷導(dǎo)致成熟期認(rèn)知缺陷，發(fā)育階段PAX6缺失導(dǎo)致皮層、皮層間及皮層內(nèi)連接嚴(yán)重缺損，這成為鼠及人類出生后認(rèn)知缺損的基礎(chǔ)［4］。作為早期表達(dá)的PAX6基因多態(tài)性，可能通過調(diào)節(jié)發(fā)育中或成年的大腦而參與偏執(zhí)型精神分裂癥的發(fā)生［5］。同時(shí)也有報(bào)道稱，PAX6促進(jìn)精神分裂癥可能是通過破壞維甲酸的信號(hào)途徑［23］。mRNA的3'-UTR作為mRNA的一部分，具有miRNA、siRNA的靶位點(diǎn)，miRNA或siRNA結(jié)合靶位點(diǎn)后可引起mRNA的降解或抑制翻譯起始，其調(diào)控自身mRNA的功能已為人們所熟知。本研究通過檢索HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)在PAX6基因3'-UTR區(qū)選取其中兩個(gè)標(biāo)簽 SNP rs3026401、rs1506 位點(diǎn)［24］，既往也有這兩個(gè)位點(diǎn)在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的相關(guān)研究［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，患者組SNP rs1506基因型、等位基因頻率分布頻率與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而SNP rs3026401基因型、等位基因分布頻率與精神分裂癥均相關(guān)，提示PAX6基因rs3026401多態(tài)性可能是精神分裂癥的危險(xiǎn)因素之一。我們進(jìn)一步比較了SNP rs3026401不同基因型的PANSS評(píng)分情況，結(jié)果顯示陽性癥狀評(píng)分、一般病理因子評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陰性癥狀評(píng)分存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中GG型陰性癥狀評(píng)分顯著高于AA、AG型，這可能是PAX6基因rs3026401多態(tài)性引起精神分裂癥易感的重要原因;但目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)此方面的報(bào)道較少，有待進(jìn)一步研究以驗(yàn)證。

本研究還存在不足之處，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)化診斷分類的基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，通過LD及普通關(guān)聯(lián)分析的方法在不同人群中重復(fù)研究，以進(jìn)一步明確該位點(diǎn)與精神分裂癥易感性的關(guān)系。同時(shí)，還應(yīng)對(duì)PAX6基因rs3026401位點(diǎn)在精神分裂癥中的具體功能進(jìn)行研究，以進(jìn)一步發(fā)展與疾病相關(guān)的生物學(xué)內(nèi)表型的分析，這將更有利于深入探討精神分裂癥發(fā)生的基礎(chǔ)，為更好的預(yù)防和治療精神分裂癥提供理論支持。

［1］Prasad KM，Keshavan MS.Structural cerebral variations as useful endophenotypes in schizophrenia:do they help construct"extended endophenotypes"［J］.Schizophr Bull，2008，34(4):774-790.

［2］Shenton ME，Dickey CC，F(xiàn)rumin M，et al.A review of MRI findings in schizophrenia［J］.Schizophr Res，2001，49(1-2):1-52.

［3］Kircher TT，Thienel R.Functional brain imaging of symptoms and cognition in schizophrenia［J］.Prog Brain Res，2005(150):299-308.

［4］Tuoc TC，Radyushkin K，Tonchev AB，et al.Selective cortical layering abnormalities and behavioral deficits in cortex-specific Pax6 knock-out mice［J］.J Neurosci，2009，29(26):8335-8349.

［5］Stober G，Syagailo YV，Okladnova O，et al.Functional PAX-6 gene-linked polymorphic region:potential association with paranoid schizophrenia［J］.Biol Psychiatry，1999，45(12):1585-91.

［6］Shi YY，He L.SHEsis，a powerful softw are platform for analyses of linkage disequilibrium，haplotype construc tion，and genetic assoc iation at polymorphismloci［J］.Cell Res，2005，15(2):97-981.

［7］Jablensky A.Epidemiology of schizophrenia:the global burden of disease and disability［J］.Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci，2000，250(6):274-285.

［8］李霞，潘麗，金國(guó)東，等.帕利哌酮緩釋膠囊治療青少年精神分裂癥的療效及安全性［J］.山東醫(yī)藥，2011，15(51):96-97.

［9］Stoykova A，F(xiàn)ritsch R，Walther C，et al.Forebrain patterning defects in Small eye mutant mice［J］.Development，1996，122(11):3453-3465.

［10］Engelkamp D，Rashbass P，Seawright A，et al.Role of Pax6 in development of the cerebellar system［J］.Development，1999，126(16):3585-3596.

［11］Maekawa M，Takashima N，Arai Y，et al.Pax6 is required for production and maintenance of progenitor cells in postnatal hippocampal neurogenesis［J］.Genes Cells，2005，10(10):1001-1014.

［12］Jun H，Mohammed Qasim Hussaini S，Rigby MJ，et al.Functional role of adult hippocampal neurogenesis as a therapeutic strategy for mental disorders［J］.Neural Plasticity，2012(2012):1-20.

［13］Sakurai K，Osumi N.The neurogenesis-controlling factor，Pax6，inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes［J］.J Neurosci，2008，28(18):4604-4612.

［14］Mitchell TN，F(xiàn)ree SL，Williamson KA，et al.Polymicrogyria and absence of pineal gland due to PAX6 mutation［J］.Ann Neurol，2003，53(5):658-663.

［15］Free SL，Mitchell TN，Williamson KA，et al.Quantitative MR image analysis in subjects with defects in the PAX6 gene［J］.Neuroimage，2003，20(4):2281-2290.

［16］Stefan MD，Murray RM.Schizophrenia:developmental disturbance of brain and mind［J］.Acta Paediatr Suppl，1997，86(422):112-116.

［17］Bladessarini RJ.Schizophrenia［J］.N Engl J Med，1977，297(18):988-995.

［18］Saha S，Chant D，Welham J，et al.A systematic review of the prevalence of schizophrenia［J］.PloS Medicine，2005，2(5):413-433.

［19］Macdonald AW，Schulz SC.What we know:findings that every theory of schizophrenia should explain［J］.Schizsophrenia Bulletin，2009，35(3):493-508.

［20］潘成英，岳偉華，盧天蘭.代謝型谷氨酸受體-3基因多態(tài)性和精神分裂癥臨床癥狀關(guān)聯(lián)研究［J］.中國(guó)心理衛(wèi)生雜志，2009，23(7):528-532.

［21］孫偉，閆俊，王力芳，等.精神分裂癥斷裂基因1(DISC1)多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究［J］.中國(guó)心理衛(wèi)生雜志，2009，23(8):590-594.

［22］Maekawa M，Takashima N，Matsumata M，et al.Arachidonic acid drives postnatal neurogenesis and elicits a beneficial effect on prepulse inhibition，a biological trait of psychiatric illnesses［J］.PLoS One，2009，4(3):1-9.

［23］Lamantia AS.Forebrain induction，retinoic acid，and vulnerability to schizophrenia:insights from molecular and genetic analysis in developing mice［J］.Biol Psychiatry，1999，46(1):19-30.

［24］Hammond CJ，Andrew T，Mak YT，et al.A susceptibility locus for myopia in the normal population is linked to the PAX6 gene region on chromosome 11:a genomewide scan of dizygotic twins［J］.Am J Hum Genet，2004，75(2):294-304.

［25］Jiang B，Yap MK，Leung KH，et al.PAX6 haplotypes are associated with high myopia in Han chinese［J］.PLoS One，2011，6(5):1-10.