安 靜，楊晉翔，賀梅娟，彭繼升，魏 玥，賈雪晴

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029;2北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院;3中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì))

Pten基因作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、移動(dòng)、信號(hào)傳遞等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，它的正常表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞周期的調(diào)控以及抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，Pten基因啟動(dòng)子的甲基化與胃癌的發(fā)生有關(guān)，Pten甲基化是胃癌患者診斷及預(yù)后的候選標(biāo)志物之一［1］。近幾年發(fā)現(xiàn)，Runx3是胃癌特異性很高的一個(gè)抑癌基因［2］。Runx3在胃黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及分化調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用［3］，其有望成為胃癌診斷的一個(gè)特異性生物學(xué)標(biāo)志物和基因治療靶點(diǎn)。2013年10～12月，我們采用DNA序列分析法對(duì)大鼠Pten和 Runx3基因5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)序列的CpG島、啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，旨在為下一步大鼠Pten和Runx3基因甲基化實(shí)驗(yàn)上下游引物設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大鼠Pten和Runx3基因全長(zhǎng)序列、轉(zhuǎn)錄本信息獲得 通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索 Genebank 獲得大鼠Pten、Runx3基因的登陸號(hào)、全長(zhǎng)序列及轉(zhuǎn)錄本信息。

1.2 大鼠Runx3和Pten基因外顯子、內(nèi)顯子及上游5'-UTR信息獲得 通過序列比對(duì)，利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心Blast中的可讀框(ORF)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找分析確定外顯子和內(nèi)顯子及5'-UTR，也可通過Ensemble查找外顯子、內(nèi)顯子及5'-UTR，取翻譯起始點(diǎn)(ATG)前2 kb、后1 kb的區(qū)域序列做后續(xù)分析。

1.3 大鼠Pten和Runx3基因5'-UTR上游CpG島、啟動(dòng)子區(qū)域及其轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 采用序列分析。

1.3.1 CpG島分析 應(yīng)用開放CpG island searcher軟件(http://cpgislands.usc.edu/)、在線 CpGPlot工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)、Methprimer2.0 工具(http://www.urogene.org/methprimer/)預(yù)測(cè)CpG島。①Pten基因CpG島分析:CpG island searcher設(shè)定條件:選擇低限%GC(G、C百分比)=50，CpG島實(shí)測(cè)值/預(yù)期值(ObsCpG/ExpCpG)=0.65，長(zhǎng)度(Length)=200，距離(Distance)=100。CpGPlot設(shè)定條件:實(shí)測(cè)值/預(yù)期值(Obs/Exp)＞0.60，Percent C+Percent G ＞50.00，Length ＞ 200。Methprimer2.0設(shè)定條件:CpG島長(zhǎng)度(Island size)＞200，GC Percent＞50.0，Obs/Exp ＞0.60。②Runx3基因CpG島分析:CpG island searcher設(shè)定條件:選擇低限%GC=50，ObsCpG/ExpCpG=0.65，Length=200，Distance=100。CpGPlot設(shè)定條件:Obs/Exp ＞0.60，Percent C+Percent G ＞ 50.00，Length ＞ 200。Methprimer2.0設(shè)定條件:Island size＞200，GC Percent＞50.0。

1.3.2 啟動(dòng)子信息預(yù)測(cè) 應(yīng)用開放軟件NNPP工具(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、Promoter scan 工具(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)、FirstEF 工 具 (http://rulai.cshl.org/tools/FirstEF)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子。

1.3.3 啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 應(yīng)用開放在線工具/軟件 Matlspector(http://www.genomatix.de/)、Match(http://www.gene-regulation.com)和Consite(http://consite.genereg.net)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Pten和Runx3基因全長(zhǎng)序列及其轉(zhuǎn)錄本序列 大鼠Pten基因位于染色體1q41～q43，全長(zhǎng)65 kb，登陸號(hào):50557;有 3個(gè)轉(zhuǎn)錄本:AF455569、AF017185、NM_031606，均為 1 212 bp。大鼠 Runx3基因位于染色體5q36，全長(zhǎng)73 kb，登陸號(hào):156726;有2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本:AF421886.1、NM_130425.1，均為1 230 bp。

2.2 大鼠Pten和Runx3基因外顯子、內(nèi)顯子及上游5'-UTR信息 通過BLAST序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所報(bào)道的Runx3和Pten基因其轉(zhuǎn)錄本5'-UTR長(zhǎng)度均相等，且轉(zhuǎn)錄本序列高度一致。通過Ensemble查找外顯子和內(nèi)顯子及5'-UTR顯示，Runx3基因第1外顯子(起始外顯子)長(zhǎng)度為285 bp，Pten基因第1外顯子(起始外顯子)長(zhǎng)度為79 bp。兩個(gè)基因取5'端翻譯起始密碼子(ATG)前2 kb、后1 kb序列進(jìn)行后續(xù)分析。

2.3 Pten基因和Runx3基因CpG島的分析結(jié)果

2.3.1 Pten基因 CpG island searcher軟件分析結(jié)果:CpG島(－1 952～ －70)，ObsCpG/ExpCpG=0.808，Length=1 883。CpGPlot工具分析結(jié)果:CpG島1(－1 872～ －1 599)，274 bp;CpG 島 2(－1 493～－144)，1 290 bp。Methprimer2.0 工具預(yù)測(cè)結(jié)果:CpG島1(－1 872～ －1 599)，274 bp;CpG 島2(－1 493～－144)，1 290 bp 。

2.3.2 Runx3基因 CpG island searcher軟件分析結(jié)果，見表 1;CpGPlot工具分析結(jié)果，見表 2。Methprimer2.0工具分析結(jié)果與CpGPlot工具分析結(jié)果相同。

表1 Runx3基因CpG island searcher軟件分析結(jié)果

表2 Runx3基因CpGPlot工具分析結(jié)果

2.4 Pten基因和 Runx3基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果NNPP工具預(yù)測(cè)結(jié)果，見表3。Pten基因FirstEF工具顯示CpG島的－1 253～－684 bp是1個(gè)啟動(dòng)子序列，第1外顯子序列為－753～691 bp;Runx3基因FirstEF工具序列－690～－121 bp是1個(gè)啟動(dòng)子序列，第1外顯子序列為－108～41 bp。Promoter scan工具預(yù)測(cè)結(jié)果，見表4。

2.5 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) Pten基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析軟件分別顯示CpG島啟動(dòng)子區(qū)上有100、68和107個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包含有109種轉(zhuǎn)錄因子;在這109種轉(zhuǎn)錄因子中，被≥2種軟件共同預(yù)測(cè)有結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子有6種。Runx3基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析軟件分別顯示，CpG島啟動(dòng)子區(qū)上有138、71和97個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包含有94種轉(zhuǎn)錄因子;在這94種轉(zhuǎn)錄因子中，被≥2種軟件共同預(yù)測(cè)有結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子有9種。見表5。

表3 Pten基因和Runx3基因NNPP工具啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果

表4 Pten基因和Runx3基因Promoter scan工具啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織或惡性細(xì)胞系中存在Pten基因低表達(dá)或缺失，并且大部分與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化相關(guān)。目前認(rèn)為，突變、雜和性缺失(LOH)及異常甲基化是導(dǎo)致Pten基因失活的主要機(jī)制。Runx3在正常胃黏膜上皮細(xì)胞廣泛表達(dá)，對(duì)胃癌高發(fā)區(qū)大樣本人群的研究證明，Runx3蛋白表達(dá)與胃黏膜病變的嚴(yán)重程度呈明顯負(fù)相關(guān)［4］。胃癌組織中Runx3 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯低于相應(yīng)正常組織，在不同進(jìn)展和分化程度的胃癌組織中，Runx3表達(dá)也明顯下調(diào)，表明Runx3基因與胃癌的進(jìn)展密切相關(guān)［5］。目前發(fā)現(xiàn)有多種機(jī)制，包括LOH、高甲基化和點(diǎn)突變等參與了Runx3基因在胃癌中的表達(dá)缺失或下調(diào)，其中Runx3啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化是導(dǎo)致其在胃癌中失活的主要機(jī)制。

表5 Pten基因和Runx3基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析預(yù)測(cè)結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠Pten基因和Runx3基因的轉(zhuǎn)錄本5'端及其上游序列完全位于CpG島內(nèi)，表明該基因?qū)儆贑pG島關(guān)聯(lián)基因，適合利用FirstEF進(jìn)行第1外顯子分析。同時(shí)，對(duì)于CpG相關(guān)基因FirstEF軟件對(duì)啟動(dòng)子和第1外顯子預(yù)測(cè)的敏感性與特異性均高達(dá)90%以上。所以，初步確定大鼠Pten基因和Runx3基因核心啟動(dòng)子可能分別位于－1 253～－684 bp和－690～－121 bp，為進(jìn)一步基因調(diào)控甲基化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

近幾年，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，基因組DNA和蛋白質(zhì)測(cè)序數(shù)據(jù)總量正在以指數(shù)倍的速度增長(zhǎng)。如何挖掘利用現(xiàn)有海量數(shù)據(jù)來預(yù)測(cè)有關(guān)基因的CpG島、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是生物信息學(xué)研究熱點(diǎn)。

CpG島指一段200 bp或更長(zhǎng)序列的DNA序列，G+C含量較高［6］。CpG島通常位于基因的5'端，尤其是啟動(dòng)子和第1外顯子附近，人類基因概率達(dá)60%～80%，也是發(fā)生甲基化的區(qū)域［7］。本研究中所應(yīng)用軟件在ATG上游均檢測(cè)到典型的CpG島結(jié)構(gòu)，相關(guān)基因CpG島與啟動(dòng)子和第1外顯子高度重合，因此查找CpG島能對(duì)基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)有重要意義。

預(yù)測(cè)有關(guān)基因的啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有許多算法，而且還有很多軟件和工具提供在線分析。本研究預(yù)測(cè)啟動(dòng)子分別基于信號(hào)的預(yù)測(cè)方法和基于內(nèi)容的預(yù)測(cè)方法。Promtor Scan屬于基于信號(hào)方法識(shí)別核心啟動(dòng)子TATA-box、CAAT-box和TSS等一些重要的啟動(dòng)子調(diào)控元件;NNPP工具預(yù)測(cè)啟動(dòng)子是基于信號(hào)內(nèi)容的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別TATA-box、CAAT-box、加帽位點(diǎn)和GC框的位置和距離，使用4個(gè)結(jié)構(gòu)相同的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分別識(shí)別以上4種元件來區(qū)別啟動(dòng)子和非啟動(dòng)子。另外，基于相關(guān)基因CpG島高關(guān)聯(lián)性，還可采用CpG島關(guān)聯(lián)性的預(yù)測(cè)方法。FirstEF是基于二次判別析分析技術(shù)［8］，先判斷是否為CpG島相關(guān)，然后通過搜索第1外顯子數(shù)據(jù)庫，識(shí)別RNA聚合酶酶切點(diǎn)，最后結(jié)合CpG島信息，確定啟動(dòng)子區(qū)。因使用了3種不同的二次判別函數(shù)，使該方法預(yù)測(cè)含CpG島的啟動(dòng)子的敏感性和特異性都高于0.90［9］，預(yù)測(cè)不含CpG島的啟動(dòng)子的精確性相對(duì)略低。盡管目前預(yù)測(cè)工具很多，但對(duì)啟動(dòng)子識(shí)別精度都不高［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)基因與CpG島關(guān)聯(lián)明顯，結(jié)合其他算法對(duì)相關(guān)基因啟動(dòng)子重要調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

由于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是一段包含在基因啟動(dòng)子中的DNA序列，研究基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是密不可分的。本研究選取相關(guān)基因預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域DNA序列進(jìn)行相關(guān)基因數(shù)據(jù)分析，同樣也有很多方法和軟件/工具可供選擇。MatIspector［11］和Match是基于位置權(quán)重矩陣(PWN)來描述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的在線工具，根據(jù)已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建矩陣來描述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的各個(gè)位點(diǎn)的堿基組成［12］。該工具可以迅速識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);缺點(diǎn)是由于背景噪音的干擾，出現(xiàn)許多無功能的假陽性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)［13］。Consite是基于進(jìn)化發(fā)育足跡法，通過多物種間基因同源性進(jìn)行交叉比對(duì)查找啟動(dòng)子區(qū)保守區(qū)共同存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位，降低了假陽性率，使預(yù)測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確［14］。值得注意的是，轉(zhuǎn)錄因子長(zhǎng)度較短，無論同源匹配還是模式識(shí)別，其假陽性比例都會(huì)很高［15］，因此，啟動(dòng)子區(qū)域識(shí)別最好基于外顯子/內(nèi)顯子以及CpG島預(yù)測(cè)的結(jié)果做綜合判斷。本研究綜合基于外顯子/內(nèi)顯子以及CpG島預(yù)測(cè)的結(jié)果，采用3種不同數(shù)據(jù)庫來源的在線軟件/工具并利用兩種序列分析預(yù)測(cè)方法來預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，可有效降低假陽性率，但仍然不能排除無實(shí)際功能的結(jié)合位點(diǎn)，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

通過DNA和蛋白質(zhì)序列分析預(yù)測(cè)技術(shù)，生物信息數(shù)據(jù)應(yīng)用到系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育預(yù)測(cè)、基因結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)等方面，結(jié)果得到進(jìn)一步應(yīng)用和認(rèn)可，同時(shí)也存在著諸多不足之處，但隨著基因組序列信息的日益豐富，計(jì)算方法和數(shù)據(jù)庫的不斷完善，可以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方向和進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)技術(shù)，基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制也將逐步得到闡明。

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