李玲霞，王志巧，羅曉麗，宋麗娜＊，于珊珊，何成彥，趙麗純，李洪軍，趙海豐，武利濤

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春130021；3.佳木斯大學(xué)第一臨床學(xué)院，黑龍江 佳木斯154003；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院）

含 CUB 結(jié)構(gòu)域蛋白1（CUB Domain－containing Protein 1，CDCP1）是一種細(xì)胞表面糖蛋白。研究證實(shí)CDCP1為一種新的干細(xì)胞標(biāo)志物［1］表達(dá)失調(diào)與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［2－7］。CDCP1為腫瘤輔助診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。鑒于目前國內(nèi)應(yīng)用的CDCP1抗體制劑多為國外公司進(jìn)口，因此研制CDCP1抗體制劑，可滿足國內(nèi)在系統(tǒng)地探討CDCP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫診斷和靶向治療中的需求。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞株及菌種與質(zhì)粒

人肺腺癌細(xì)胞株A549由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗(yàn)科保存、大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3）、pGEX－KG由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗(yàn)科保存。

1.2 主要試劑

Trizol（Invitrogen）、Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、rTaq聚合酶、dNTP、T4連接酶（TaKaRa）、膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒（愛思進(jìn)生物技術(shù)公司）、IPTG、丙烯酰胺、N，N－甲叉雙丙烯酰胺（Sigma）。

引物由上海生工合成，引物序列如下：上游引物：5’－CGC GGATCC ATG AGCTGCCCAGACGGAGTCAC－3’；下游引物：5’－CG GAATTC TCA AGACATCAGGGTTGCTGAGC－3’。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1總RNA的提取 按Trizol試劑說明提取肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549總RNA，測定RNA含量及260 nm和280nm的吸收值的比值。

1.3.2cDNA第一條鏈的合成 按Takara的Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit操作步驟完成。

1.3.3PCR反應(yīng) 取cDNA 反應(yīng)液1μl，加入0.5 ml PCR管中，分別加入2mmol／L dNTP 4μl，10×PCR緩沖液5μl，上、下游引物各1μl（10.0pmol／μl），Taq酶2.5U，加DEPC水至終體積50μl，反應(yīng)條件為94℃變性1min，57℃退火45s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。取9μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在圖像分析處理系統(tǒng)上觀察、記錄電泳結(jié)果。

1.3.4表達(dá)載體的構(gòu)建 堿性裂解法小量制備質(zhì)粒；酶切反應(yīng)混合物經(jīng)震蕩混勻、孵育后得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收酶切產(chǎn)物并將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；將連接反應(yīng)混合物震蕩混勻，連接過夜；制備轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，放于37℃培養(yǎng)。

1.3.5重組克隆的篩選和鑒定 通過雙酶切及PCR鑒定確認(rèn)陽性的克隆，進(jìn)行基因序列測定。測序結(jié)果在NCBI Human RefSeq數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，查看所克隆序列是否為目的序列，是否有缺失或者突變。

1.3.6GST－CDCP1 融合蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá) 將pGEX－KG／CDCP1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中，經(jīng)氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化后菌落，挑取不同單克隆小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定。誘導(dǎo)表達(dá)前一天將pGEX－KG／CDCP1重組菌（BL21）培養(yǎng)過夜，留1ml菌液做為陰性對照，剩余培養(yǎng)液中加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心后將沉淀懸于Tris緩沖液中；取上述制備的懸液與上樣緩沖液混勻，加熱離心后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色，洗脫，直至觀察到清晰的條帶。

2 結(jié)果

2.1 CDCP1基因的擴(kuò)增

以肺腺癌細(xì)胞株A549的mRNA為模板，應(yīng)用所設(shè)計(jì)的引物通過RT－PCR法擴(kuò)增CDCP1胞外段基因目的片段。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：在約270bp處擴(kuò)增出單一條帶，大小與預(yù)計(jì)相符，見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒pGEX－KG／cdcp1的篩選及鑒定

將PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，定向插入同樣經(jīng)雙酶切的pGEX－KG載體中，獲得重組質(zhì)粒pGEX－KG／CDCP1。經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切、PCR及DNA序列測定對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，篩選出與GST之間讀碼框架正確的重組質(zhì)粒，酶切鑒定、PCR鑒定見圖2、圖3。

圖1 RT－PCR擴(kuò)增CDCP1基因目的片段

圖2 重組質(zhì)粒pGEX－KG／CDCP1的酶切鑒定

圖3 重組質(zhì)粒pGEX－KG／CDCP1的PCR鑒定

2.3 融合蛋白GST－CDCP1在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

含PGEX－KG／CDCP1重組子的BL21用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h后，SDS－PAGE分析可見，與誘導(dǎo)前相比，在相對分子質(zhì)量約35kD處出現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)蛋白條帶，分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致，見圖4。

3 討論

CDCP1是一種細(xì)胞跨膜糖蛋白。CDCP1表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤相關(guān)［8］。有研究比較了結(jié)腸腺癌和鄰近正常組織，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性度與CDCP1染色強(qiáng)度相關(guān)［9］。在一項(xiàng)腎細(xì)胞癌研究中也觀察到，正常腎臟細(xì)胞未檢測到CDCP1表達(dá)，而33.5%癌癥病例檢測到CDCP1的表達(dá)，而且CDCP1的表達(dá)與腫瘤分期、組織學(xué)分級和轉(zhuǎn)移等進(jìn)展性疾病指標(biāo)顯著相關(guān)。到目前為止有關(guān)CDCP1在腫瘤細(xì)胞中的功能了解較少，但可明確其為上皮來源腫瘤抗原，并為高轉(zhuǎn)移性表皮樣癌的腫瘤相關(guān)蛋白。CDCP1在細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間黏附中起重要作用。CDCP1通過與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮其生物學(xué)作用，但目前還了解較少。能力的生物學(xué)特征了解的很少。而在正常的肺［10］、結(jié)腸［11］、睪丸等組織中檢測到CDCP1低水平表達(dá)。CDCP1也是白血病細(xì)胞［12］、骨髓和間充質(zhì)干／祖細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞［10］。

圖4 SDS－PAGE分析融合蛋白GST－CDCP1的表達(dá)

鑒于CDCP1為一種腫瘤相關(guān)抗原，且為跨膜蛋白，CDCP1是腫瘤診斷與治療的較理想的靶點(diǎn)［13］。最近應(yīng)用基因工程抗CDCP1發(fā)現(xiàn)，靶向CDCP1阻斷腫瘤發(fā)展。在體外，該抗體阻斷前列腺癌PC－3細(xì)胞的遷移和侵襲［4］。

目前有關(guān)CDCP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展作用及CDCP1信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的研究較少。因此研制新型、價(jià)格適宜的CDCP1抗體有助于促進(jìn)國內(nèi)進(jìn)行更廣泛深入的有關(guān)CDCP1生物學(xué)作用的研究。

本研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX－K／CDCP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)。下一步將通過親和層析純化CDCP1－GST融合蛋白，經(jīng)免疫印記鑒定后免疫動物制備多克隆抗體，并通過B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，抗體經(jīng)初步純化，選擇肺癌、結(jié)腸癌等組織標(biāo)本和血液標(biāo)本進(jìn)行抗體特異性鑒定。

綜上所述，我們成功克隆了CDCP1胞外段基因序列并構(gòu)建了pGEX－KG／CDCP1原核表達(dá)載體。本研究工作，為CDCP1抗體的制備奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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