劉建民,王華,毛慧芳,郝青,洪亞群,彭銳,陳澤斌

“雙固一通”電針對(duì)老年陽(yáng)虛模型大鼠淋巴細(xì)胞凋亡和促炎因子IL-6、IL-1b的影響

劉建民,王華,毛慧芳,郝青,洪亞群,彭銳,陳澤斌

(湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430061)

探討“雙固一通”電針治療對(duì)老年陽(yáng)虛模型大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡和血清促炎因子IL-6及IL-1b的影響。選用SD大鼠,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)、老年陽(yáng)虛模型組(Model)、“雙固一通”電針組(EA)和電針對(duì)照組(EAc)。除NC組外,其余3組大鼠均通過(guò)皮下注射D-半乳糖40 d,后繼續(xù)肌肉注射氫化可的松7 d,誘導(dǎo)為老年陽(yáng)虛模型。EA組取關(guān)元、后三里和百會(huì)穴治療,EAc組取中極、陰陵泉、印堂穴治療。每星期治療6次,共治療4星期。采用Annexin V雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率;酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中IL-6、IL-1b含量的變化。與NC組相比,Model組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率顯著上升(＜0.01),血清IL-6及IL-1b含量均顯著增高(＜0.01);與Model組相比,EA組和EAc組大鼠上述指標(biāo)均明顯降低(＜0.01,＜0.05),且EA組上述指標(biāo)下降更顯著,與EAc組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。電針能明顯降低老年陽(yáng)虛模型大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率和血清中促炎因子IL-6、IL-1b的含量,提示電針對(duì)老年陽(yáng)虛證導(dǎo)致的免疫失衡和炎性因子失衡有治療作用,且“雙固一通”配穴的電針療效優(yōu)于鄰近對(duì)照配穴的療效。

電針;陽(yáng)虛證;“雙固一通”電針?lè)?細(xì)胞凋亡;白細(xì)胞介-6;白細(xì)胞介素-1b;大鼠

陽(yáng)虛證為中醫(yī)學(xué)基本證型之一,陽(yáng)虛證的發(fā)生與個(gè)體衰老存在密切關(guān)聯(lián)[1]。有學(xué)者從自然衰老角度切入為研究陽(yáng)虛證提供了新的思路,有關(guān)藥物調(diào)控免疫衰老效應(yīng)及機(jī)制在陽(yáng)虛證的探討方面已有明確研究報(bào)道[2-3],而從免疫衰老角度探討針灸方法對(duì)老年陽(yáng)虛證的調(diào)控療效及作用機(jī)制尚不多見。由王華教授提出的“雙固一通”針灸法以中醫(yī)針灸學(xué)理論為指導(dǎo),將固護(hù)人體先天之本和后天之本及通瀉病邪作為防治疾病要點(diǎn),借助針灸作用于人體強(qiáng)壯要穴和阿是穴達(dá)到以外治內(nèi)、固本祛邪目的[4],是針灸穴位配伍應(yīng)用的新的啟示和參考。近來(lái)研究顯示“雙固一通”針灸法在扶助正氣、改善陽(yáng)虛證方面具有一定的優(yōu)勢(shì)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖和氫化可的松誘導(dǎo)的老年陽(yáng)虛模型大鼠為研究對(duì)象,從細(xì)胞凋亡與促炎因子IL-6和IL-1b含量變化方面探討“雙固一通”電針?lè)▽?duì)老年陽(yáng)虛模型大鼠免疫失衡和炎性失衡調(diào)控的效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson提供);HANS-LH202H型電針儀(北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司提供);KDC- 160HR高速冷凍離心機(jī)(上海嘉鵬科技有限公司提供);KHB-st360型酶標(biāo)儀(上?？迫A公司提供);DH 3600 AB電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津)。

胎牛血清由杭州四季青生物科技有限公司提供;RPMI-1640培養(yǎng)基由美國(guó)Gibco公司提供; Annexin-V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由深圳聯(lián)科生物有限公司提供;大鼠IL-6和IL-1b酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)由欣博盛生物有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及造模

5月齡SD健康大鼠40只[華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2004- 0007],均為雌性,清潔級(jí),體重為(200±20)g,根據(jù)簡(jiǎn)單隨機(jī)排序法分為正常對(duì)照組(NC)、老年陽(yáng)虛模型組(Model)、“雙固一通”電針組(EA)和電針對(duì)照組(EAc),每組10只。所有大鼠正常喂養(yǎng)1星期后,開始制作老年陽(yáng)虛模型,除NC組外,其余各組按每鼠每日125 mg/kg D-半乳糖給予頸背部皮下連續(xù)注射40 d,之后再行后腿肌肉注射氫化可的松1.5 mg/100 g連續(xù)7 d,NC組大鼠每日皮下注射等量0.9%生理鹽水1次,連續(xù)47 d。

1.3 治療及處理方法

NC組采用正常飼養(yǎng)(以下各組略),不進(jìn)行造模及電針治療。Model組進(jìn)行造模,不予電針治療。

EA組造模成功后,參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》取關(guān)元、后三里和百會(huì),采用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.35 mm×25 mm毫針進(jìn)行針刺,關(guān)元向上斜刺2～3 mm,后三里直刺2～3 mm,百會(huì)平刺5 mm。關(guān)元和后三里穴接HANS-LH202H型電針儀,選用連續(xù)波,頻率2 Hz,強(qiáng)度為1 mA,留針15 min。每日1次,每星期6次,共治療4星期。

EAc組造模成功后,取中極、陰陵泉、印堂,針刺和電針操作同EA組。

NC組與Model組相同方法、相同時(shí)間段內(nèi)抓取固定。各組大鼠治療結(jié)束后,禁食24 h,取材,進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本采集

腹腔注射10%水合氯醛麻醉,左心室穿刺抽血,用干凈試管收集血液,室溫凝固30 min,3000 r/min離心10 min,收集血清,立即放﹣20℃冷凍保存。采血后,斷頸處死大鼠,立即剖腹取出脾臟,剝離干凈,生理鹽水沖洗備用。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 脾臟淋巴細(xì)胞凋亡檢測(cè)

脾臟經(jīng)200目篩網(wǎng)研磨過(guò)濾,用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol,pH7.4)洗滌2次,每次1000 r/min各離心10 min取上清,收集細(xì)胞。用加入10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,以1×結(jié)合緩沖液(binding buffer)調(diào)整細(xì)胞濃度5×106細(xì)胞/mL,制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞百分率。具體步驟為,取100mL樣品,每份樣品加入500mL孵育緩沖液重懸細(xì)胞,加入5mL Annexin V -FITC和10mL PI標(biāo)記溶液;輕微混勻細(xì)胞,室溫下避光孵育5 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.5.2 血清中IL-6和IL-1b表達(dá)水平的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)測(cè)定,具體步驟按試劑盒要求進(jìn)行操作,最后在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析,組間比較采用檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 模型評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖和氫化可的松誘導(dǎo)制作老年陽(yáng)虛模型大鼠,是在黃兆勝等[7]制作阿爾茨海默病腎陽(yáng)虛模型大鼠的啟示下開展的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,造模后的大鼠表現(xiàn)為拱背蜷曲、肢尾冷、擠臥一起,被毛蓬松、失去光澤,足趾浮腫,舌淡胖苔潤(rùn),神疲、少食、反應(yīng)遲鈍、小便多等虛損狀,根據(jù)中醫(yī)學(xué)陽(yáng)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)[8],類似“陽(yáng)虛”狀態(tài)。

2.2 各組大鼠淋巴細(xì)胞凋亡率比較

NC組、Model組、EA組和EAc組淋巴細(xì)胞凋亡率分別為12.0%、25.9%、14.4%和21.8%。與NC組相比較,Model組大鼠淋巴細(xì)胞凋亡率顯著增加(＜0.01);與Model組比較,經(jīng)電針處理的EA組和EAc組大鼠淋巴細(xì)胞凋亡率均明顯降低(＜0.01,＜0.05);而與EAc組比較,EA組大鼠淋巴細(xì)胞凋亡率下降更加顯著(＜0.05);EA組大鼠淋巴細(xì)胞凋亡率與NC組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),而EAc組與NC組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。這些結(jié)果表明,電針對(duì)陽(yáng)虛證模型大鼠淋巴細(xì)胞凋亡率的下降均有拮抗干預(yù)作用,但“雙固一通”電針?lè)ㄗ饔酶@著。各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

2.3 各組大鼠血清IL-6水平比較

本研究結(jié)果顯示,NC組大鼠血清IL-6含量為(111.89±14.50) pg/mL,Model組為(155.88±19.60) pg/mL,EA組為(122.65±13.80) pg/mL,EAc組為(136.65±10.50) pg/mL。Model組大鼠血清IL-6含量高于NC組,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);經(jīng)電針處理的EA組和EAc組大鼠血清IL-6含量明顯低于Model組(＜0.05,＜0.01);EA組大鼠血清IL-6含量與EAc組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);EA組大鼠血清IL-6含量與NC組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);EAc組大鼠血清IL-6含量與NC組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。提示電針能明顯降低陽(yáng)虛模型大鼠血清IL-6的含量,其中“雙固一通”電針?lè)ㄗ饔酶@著,優(yōu)于EA組。

2.4 各組大鼠血清IL-1b水平比較

本研究結(jié)果顯示,NC組大鼠血清IL-b含量為(11.21±1.65) pg/mL,Model組為(15.98±1.43) pg/mL,EA組為(12.65±1.34) pg/mL,EAc組為(14.33±1.74) pg/mL。Model組大鼠血清IL-1b含量明顯高于NC組(＜0.05);EA組和EAc組大鼠血清IL-1b含量明顯低于Model組(＜0.05,＜0.01);EA組大鼠血清IL-1b含量與EAc組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。提示老年陽(yáng)虛大鼠血清促炎因子IL-1b含量增多,電針能明顯降低老年陽(yáng)虛大鼠血清IL-1b的含量,“雙固一通”電針?lè)ǒ熜?yōu)于EA組。

2.5 “雙固一通”電針對(duì)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率和血清IL-6、IL-1b表達(dá)影響的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)表明,EA組大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡率與IL-6水平作相關(guān)性分析,=0.751 [0.05(8)=0.632,r0.01(8)=0.765],＜0.05。EA組大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡率與IL-1b水平作相關(guān)性分析,=0.646,＜0.05。提示“雙固一通”電針治療對(duì)陽(yáng)虛證模型大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率的調(diào)節(jié)與對(duì)IL-6及IL-1b表達(dá)的影響呈正相關(guān)。

3 討論

機(jī)體隨增齡出現(xiàn)陽(yáng)虛質(zhì)明顯變化[9]為陽(yáng)虛證的研究提供了依據(jù),機(jī)體隨增齡出現(xiàn)免疫功能的進(jìn)行性下降,使得機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)失衡成為探討陽(yáng)虛證的重要切入[10]。夏世金等[2-3]把衰老機(jī)體免疫失衡和炎性失衡與陽(yáng)虛證相結(jié)合的研究開辟了陽(yáng)虛證研究的新方向。近來(lái)研究表明增齡性陽(yáng)虛證本質(zhì)中存在的免疫衰老與衰老進(jìn)程中促炎性細(xì)胞因子的穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)[3],其中促炎性細(xì)胞因子如TNFa、IL-6、IL-1b等細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在老年陽(yáng)虛機(jī)體免疫功能衰退或紊亂的發(fā)生中起著重要的作用[11-12]。而早在1996年Miller就提出免疫衰老可能與淋巴細(xì)胞過(guò)度凋亡有關(guān)[13],之后該結(jié)論無(wú)論是在動(dòng)物還是人體研究中都得到了確切證實(shí)[14-15]。因此,從隨增齡免疫功能的進(jìn)行性下降和慢性促炎性反應(yīng)進(jìn)行性升高是否與淋巴細(xì)胞過(guò)度凋亡有關(guān),對(duì)研究陽(yáng)虛證的發(fā)生和針灸干預(yù)相關(guān)機(jī)制十分重要。本研究以D-半乳糖和氫化可的松誘導(dǎo)陽(yáng)虛模型大鼠,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照大鼠相比,老年陽(yáng)虛模型大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率上升、血清促炎細(xì)胞因子IL-6及IL-1b含量增高,由此提示,增齡陽(yáng)虛證本質(zhì)中淋巴細(xì)胞凋亡與衰老機(jī)體的細(xì)胞炎性狀態(tài)密切相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,陽(yáng)虛證與腎密切相關(guān),腎為先天之本,腎陽(yáng)為機(jī)體之元陽(yáng),是生命活動(dòng)的原動(dòng)力,臨床很多疾病多與腎陽(yáng)虛相關(guān),尤以老年人為甚,故開展電針干預(yù)陽(yáng)虛證作用機(jī)制對(duì)于探討針灸防治以陽(yáng)虛證為特征的疾病具有積極的意義。本實(shí)驗(yàn)選穴依據(jù)王華教授“雙固一通”針?lè)╗4]而來(lái),選用具有培腎固本的關(guān)元、固護(hù)脾胃的足三里和升提陽(yáng)氣的百會(huì)為處方。關(guān)元補(bǔ)腎壯陽(yáng),承陰經(jīng)之海之精,歷來(lái)為保健強(qiáng)壯、延年益壽之要穴;足三里具有健脾益胃,促氣血生化之源強(qiáng)健,歷來(lái)亦為強(qiáng)壯機(jī)體之要穴,臨床可治諸虛百損。針刺關(guān)元、百會(huì)可補(bǔ)腎健脾,腎為先天之本,脾為后天之本,先天與后天相互依賴、相互滋養(yǎng)。百會(huì)歸屬督脈,別名“三陽(yáng)五會(huì)”,穴居巔頂,其深處即為腦之所在。三穴合用,共奏強(qiáng)身固本、溫陽(yáng)散寒之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與老年陽(yáng)虛模型組比較,“雙固一通”電針組淋巴細(xì)胞凋亡率降低,血清IL-6及IL-1b表達(dá)亦明顯降低(＜0.05,＜0.01)。提示“雙固一通”電針治療對(duì)陽(yáng)虛證模型大鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率的調(diào)節(jié)與對(duì)IL-6及IL-1b表達(dá)的影響呈正相關(guān)。為證實(shí)“雙固一通”針灸法選穴配伍的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),本實(shí)驗(yàn)選取上述關(guān)元、足三里、百會(huì)三穴的鄰近穴中極、陰陵泉、印堂作為對(duì)照,盡管對(duì)照治療也取得了一定療效,但對(duì)上述指標(biāo)的影響,“雙固一通”電針組與電針對(duì)照組之間比較表現(xiàn)出明顯差異。由此提示“雙固一通”電針?lè)▽?duì)老年模型大鼠淋巴細(xì)胞凋亡率、血清IL-6及IL-1b表達(dá)的拮抗干預(yù)作用更顯著,效果優(yōu)于非“雙固一通”針灸法思想指導(dǎo)下的配穴電針療效。這可能與實(shí)驗(yàn)已證實(shí)的選用關(guān)元、足三里兩穴扶助正氣,固本祛邪、激發(fā)人體潛在的抗病能力、延緩衰老作用的穴位特效性有關(guān)[16-17]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn),我們可以認(rèn)為“雙固一通”電針?lè)ㄔ诟深A(yù)老年陽(yáng)虛證機(jī)制中對(duì)免疫衰老和炎性衰老的療效是肯定的,為改善機(jī)體陽(yáng)虛乃至重建機(jī)體健康穩(wěn)態(tài)具有重要意義,本實(shí)驗(yàn)從穴位配伍比較研究中探索電針對(duì)老年陽(yáng)虛證的干預(yù)療效和機(jī)制,為臨床老年性疾病的針灸基本治療方案提供科學(xué)依據(jù)和借鑒。至于電針通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞凋亡率和血清促炎因子IL-6、IL-1b,其中的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

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Effect of “Double Reinforcing and One Unblocking” Electroacupuncture on Lymphocyte Apoptosis and Inflammatory Factors IL-6 and IL-1β in a Rat Model of Senile Yang Deficiency

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,430061,

To investigate the effect of “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture on splenic lymphocyte apoptosis and serum inflammatory factors IL-6 and IL-1β in a rat model of senile yang deficiency.SD rats were selected and randomly allocated to normal control group (NC), senile yang deficiency model group (model), “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture group (EA) and electroacupuncture control group (EAc). A model of senile yang deficiency was made by 7 days’ intramuscular injection of hydrocortisone following 40 days’ subdermal injection of D-galactose in all the groups of rats except the NC group. Points Guangyuan, Housanli and Baihui were selected in the EA group and points Zhongji, Yinlingquan and Yintang, in the EAc group. Treatment was given 6 times a week for a total of 4 weeks. Rat splenic lymphocyte apoptosis rate was determined using Annexin V double staining flow cytometry. Serum IL-6 and IL-1β contents were measured by enzyme-linked immunoadsorbent assay.Splenic lymphocyte apoptosis rate and serum IL-6 and IL-1β contents increased significantly in the model group of rats compared with the NC group (both＜0.01). The above indices decreased significantly in the EA and EAc groups of rats compared with the model group (＜0.01,＜0.05). The above indices decreased more in the EA group than in the EAc group; there was a statistically significant difference (＜0.05).Electroacupuncture can significantly decrease splenic lymphocyte apoptosis and serum inflammatory factors IL-6 and IL-1β contents in a rat model of senile yang deficiency, suggesting that electroacupuncture has a therapeutic effect on immune imbalance and inflammatory factor imbalance due to senile yang deficiency. The therapeutic effect of electroacupuncture by “double reinforcing and one unblocking” point combination is better than that of electroacupuncture by control adjacent point combination.

Electroacupuncture; Yang deficiency; “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture; Apoptosis; Interleukin-6; Interleukin-1β; Rats

1005-0957(2014)01-0066-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.01.0066

2013-08-07

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2008CDA051)

劉建民(1976 - ),男,副教授,博士

王華(1955 - ),男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)獒樉难ㄎ慌湮橐?guī)律研究,E-mail:Hwang.TCM@china.com