吳莎 華清泉 楊琨 肖伯奎 張志敏

阿司匹林類藥物的主要成分是水楊酸鈉，是臨床常用的解熱、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕類藥物，在心血管疾病的預(yù)防中起到重要作用[1]。該藥在治療疾病的同時(shí)，高劑量使用也會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副作用，聽力下降、耳鳴及言語認(rèn)知能力的降低是水楊酸鈉耳毒性的三大主要癥狀[2]。多年來，學(xué)者們從聽覺系統(tǒng)的不同層面探討了水楊酸鈉耳毒性的機(jī)制，包括耳蝸(形態(tài)學(xué)改變、電生理學(xué)以及生化等方面的改變)、蝸神經(jīng)(聽神經(jīng)復(fù)合動(dòng)作電位、單根耳蝸神經(jīng)纖維自發(fā)放電活動(dòng)、耳蝸神經(jīng)電生理活動(dòng)的平均譜等)以及耳蝸核、下丘和聽皮層的神經(jīng)元放電和神經(jīng)遞質(zhì)等方面的研究[3～9]，然而，至今水楊酸鈉耳毒性具體機(jī)制仍在探索中。

研究表明水楊酸鈉能夠改變聽覺中樞系統(tǒng)興奮性，聽覺中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失衡與水楊酸鈉所致耳毒性作用關(guān)系密切[10]。下丘是中樞聽覺系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)之一，具有精密加工和處理復(fù)雜聽覺信息的功能。γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與其特異性受體結(jié)合產(chǎn)生抑制性突觸后電位，谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA生成的關(guān)鍵酶，在體內(nèi)催化興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)轉(zhuǎn)化生成GABA[11]，GAD67作為GAD的亞型之一，負(fù)責(zé)維持GABA基本水平[12]。為此，本研究擬觀察長期注射水楊酸鈉對大鼠下丘GAD67蛋白表達(dá)的影響，探討其在水楊酸鈉致耳鳴、聽力下降中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 選擇健康成年Wistar大鼠18只(由湖北省預(yù)防科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不限，體重200～300 g，耳廓反應(yīng)靈敏、無中耳感染、強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為水楊酸鈉組(6只)、生理鹽水組(6只)、對照組(6只)。將水楊酸鈉(Sigma公司，S2679)溶于生理鹽水中配成10%溶液，水楊酸鈉組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉(后腿)注射水楊酸鈉175 mg/kg，2次/天，時(shí)間間隔8小時(shí)，連續(xù)注射28天[6,13]；生理鹽水組每天相同時(shí)間及部位注射等量生理鹽水，連續(xù)注射28天；對照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不予處理。

1.2ABR檢測 造模結(jié)束后，三組大鼠采用美國TDT系統(tǒng)進(jìn)行ABR檢測。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，保持肛溫37 ℃并置于隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行檢測。選用短聲(click)作為刺激聲，單耳給聲刺激，耳機(jī)發(fā)聲窗距外耳道口1 cm，刺激速率為21次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，觀察時(shí)程為10 ms，疊加次數(shù)1 024次。記錄電極置于兩側(cè)外耳道口與顱正中線交叉處皮下，參考電極置于同側(cè)耳乳突皮下，接地電極置于鼻尖正中皮下。測試聲響從110 dB SPL開始，以5 dB SPL逐次遞減，以波Ⅲ最后消失的上一強(qiáng)度作為ABR反應(yīng)閾，記錄ABR反應(yīng)閾及90 dB SPL時(shí)波Ⅲ潛伏期。

1.3Western blot檢測下丘GAD67蛋白表達(dá) ABR檢測后將三組大鼠斷頭處死并在冰盤中迅速剝離下丘，-80 ℃冰箱保存。各組標(biāo)本分別加入適當(dāng)體積組織裂解液后冰上徹底勻漿，離心后取上清液。采用Bradford方法測定蛋白濃度，各組取總蛋白40 μg經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉1小時(shí)，將PVDF膜浸泡于兔抗鼠GAD67多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗滌5 min×3次，加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫下孵育30分鐘，TBST洗滌5 min×3次，在暗室內(nèi)加入ECL化學(xué)發(fā)光底物曝光，最后用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。選用β-action作為內(nèi)參照，并用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，比較各組下丘GAD67蛋白與β-action光密度比值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組動(dòng)物ABR檢測結(jié)果 水楊酸鈉肌肉注射28天后，水楊酸鈉組ABR波形分化較差，各波振幅下降。水楊酸鈉組、生理鹽水組、對照組ABR反應(yīng)閾及波Ⅲ潛伏期見表1，可見，水楊酸鈉組ABR反應(yīng)閾較生理鹽水組、對照組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；水楊酸鈉組波Ⅲ潛伏期較生理鹽水組、對照組明顯延長，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；生理鹽水組ABR反應(yīng)閾、波Ⅲ潛伏期與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組動(dòng)物下丘GAD67蛋白表達(dá)結(jié)果 Western

表1 三組大鼠ABR反應(yīng)閾及波Ⅲ潛伏期比較

注：*與生理鹽水組、對照組比較，P<0.01

blot檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)各組均表達(dá)相對分子量約為67 kDa的GAD67蛋白。與生理鹽水組、對照組比較，水楊酸鈉組下丘GAD67蛋白表達(dá)升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)性意義(P<0.01)，而生理鹽水組與對照組下丘GAD67蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1，表2)。

圖1 Western blot檢測下丘GAD67表達(dá)

表2 三組大鼠下丘GAD67蛋白與β-action的光密度比值

注：與生理鹽水組、對照組比較，P<0.01

3 討論

阿司匹林廣泛應(yīng)用于臨床，至今約有150年的歷史。研究發(fā)現(xiàn)大劑量服用此類藥物(血藥濃度超過30 mg/dl)后，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)聽力下降及耳鳴[14]。同樣，動(dòng)物研究顯示長期注射水楊酸鈉可致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ABR各波振幅下降、反應(yīng)閾升高且潛伏期延長[15]。本研究結(jié)果顯示，水楊酸鈉組動(dòng)物肌肉注射水楊酸鈉28天后ABR反應(yīng)閾較生理鹽水組、對照組明顯升高，波Ⅲ潛伏期明顯延長；而生理鹽水組與對照組ABR反應(yīng)閾及波Ⅲ潛伏期無明顯差異，與上述報(bào)道一致，說明長期注射水楊酸鈉能夠?qū)е麓笫舐牴δ軗p傷。

在中樞聽覺系統(tǒng)中，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡是維持正常聽覺的重要因素，當(dāng)其平衡受到影響時(shí)勢必影響聽覺信號(hào)的正常輸入，導(dǎo)致聽覺障礙。GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在信號(hào)傳遞過程中起著重要的作用，可通過與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮抑制性效應(yīng)。研究指出水楊酸鈉可導(dǎo)致GABA發(fā)生下調(diào)使聽覺中樞抑制性效應(yīng)減弱，興奮性效應(yīng)增加，從而導(dǎo)致中樞聽覺系統(tǒng)神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)[16]而發(fā)生耳鳴。GAD是GABA合成的重要限速酶，在體內(nèi)催化谷氨酸(Glu)轉(zhuǎn)化為GABA，并直接影響腦組織中GABA的濃度，其在哺乳動(dòng)物大腦中存在分子量分別為65 kDa、67 kDa兩種亞型，即GAD65、GAD67[12]。GAD65可能作為一種惰性儲(chǔ)備，提供GABA生成的短期需求；而GAD67則可能為機(jī)體提供更為長程的生理調(diào)節(jié)[17]，GAD表達(dá)的上調(diào)被認(rèn)為是使GABA能神經(jīng)元抑制性功能增加而發(fā)生的代償性反應(yīng)[18]。Bauer等[19]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(8 mg/ml，連續(xù)4月)中發(fā)現(xiàn)，長期口服水楊酸鈉后GAD蛋白在動(dòng)物下丘中表達(dá)上調(diào)，而在非聽覺結(jié)構(gòu)中，GAD蛋白表達(dá)無明顯改變。本研究結(jié)果顯示，水楊酸鈉組動(dòng)物下丘GAD67蛋白表達(dá)較生理鹽水組、對照組明顯升高，而生理鹽水組與對照組GAD67蛋白的表達(dá)無明顯差異，說明長期肌肉注射水楊酸鈉能夠?qū)е麓笫笙虑餑AD67蛋白表達(dá)水平升高。推測在長期肌肉注射水楊酸鈉的過程中，聽覺通路持續(xù)性興奮，機(jī)體通過上調(diào)GAD67蛋白表達(dá)，作為負(fù)反饋以代償去抑制(GABA所介導(dǎo)抑制作用的降低)所引起的興奮與抑制的失衡狀態(tài)，促進(jìn)抑制性效應(yīng)的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究結(jié)果表明長期注射水楊酸鈉能夠引起大鼠聽力下降及下丘GAD67蛋白表達(dá)上調(diào)。GAD67蛋白表達(dá)水平的升高極有可能作為一種機(jī)體對水楊酸鈉引起耳毒性的一種抑制性代償反應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)制，其調(diào)節(jié)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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