張華 李家大 羅渾金 陳紅勝 梅凌云 賀楚峰 馮永

PAX3(Pair Box 3，配對(duì)盒基因)基因位于染色體2q35-2q37，cDNA序列全長(zhǎng)1 440 bp，其編碼的PAX3蛋白是配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子PAX家族成員之一。PAX3蛋白在脊椎動(dòng)物高度保守，是神經(jīng)嵴(neural crest，NC)發(fā)育的主要調(diào)控因子之一[1]。PAX3基因突變影響NC發(fā)育，可導(dǎo)致Waardenburg綜合征(Waardenburg syndrome，WS)[2]。WS是最常見(jiàn)的遺傳性綜合征型聾，又稱(chēng)聽(tīng)力-色素綜合征，屬NC病之一，是由于NC發(fā)育異常而導(dǎo)致的一組臨床癥候群，主要以NC源性細(xì)胞黑素細(xì)胞分化缺陷致發(fā)育異常導(dǎo)致的色素分布異常和耳聾為特征[3]。根據(jù)WS臨床特征及不同的伴隨表型將WS分為4型(WS1～4)[2]，感音神經(jīng)性聾和虹膜異色是WS最常見(jiàn)的特征性表型，PAX3基因突變可導(dǎo)致WS1和WS3。

前期研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)致WS1的新發(fā)PAX3基因突變H80D(c.238C>G)和H186fs(c.556delC)[4]，本研究通過(guò)構(gòu)建人PAX3基因及其突變H80D和H186fs表達(dá)質(zhì)粒并觀(guān)察其在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)的表達(dá)和定位，為進(jìn)一步研究國(guó)人PAX3基因突變致WS發(fā)病的分子機(jī)制奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞 NIH3T3細(xì)胞用于構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞模型，由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要試劑 野生型PAX3基因(GenBank accession no，NM181457.3)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pECE-PAX3由法國(guó)Bondurand Nadege教授惠贈(zèng)；pcDNA3.0-3×HA購(gòu)自Clontech公司；NucleoSpin Plasmid kit購(gòu)自德國(guó)Macherey-Nagel公司；Lipfectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM、FBS、Pen Strep、Opti-MEM、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Protease inhibitor cocktail、單克隆鼠抗HA抗體、TWEEN-20、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG、PMSF、ONPG、DAPI、Protein-G-Agargose、Tween-20、NP-40購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Cy2標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；fluoromount-G購(gòu)自Southern Biotech公司；Triton X-100購(gòu)自Bio Basic公司；Phusion超保真DNA聚合酶、DpnⅠ酶、NotⅠ酶、EcoRⅠ酶購(gòu)自New England Biolabs公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自TakaRa公司。

1.1.3主要儀器 Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、Leica DMI 3000B熒光倒置式生物顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)、NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo公司)、Tanon-1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、37 ℃恒溫室均由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PAX3基因重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1野生型PAX3基因重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-PAX3-HA的構(gòu)建 以獲贈(zèng)的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pECE-PAX3為模板，PCR擴(kuò)增目的片段PAX3。根據(jù)pcDNA3.0-HA的質(zhì)粒圖、序列以及多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，上游引物：5′-CGATAGAATTCATGACCACGC TGGCCGGCGC-3′，下游引物：5′-CGATACAGCGGCCGCCTAAAAAGTCCAAGG C-3′，斜體為保護(hù)堿基，下劃線(xiàn)為分別為EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μl(模板質(zhì)粒1 μl，5×HF Buffer 5 μl，dNTP 0.5 μl，Phusion超保真DNA聚合酶 0.5 μl，引物各1 μl，去離子水16 μl)，反應(yīng)條件：98 ℃變性30 s后進(jìn)行循環(huán)，98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)25次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化回收后與pcDNA3.0-HA分別由EcoRⅠ酶和NotⅠ酶雙酶切，反應(yīng)體系50 μl(純化產(chǎn)物PAX3或pcDNA3.0-HA 10 μl，EcoRⅠ 0.5 μl，NotⅠ 0.5 μl，10×Buffer 4和10×BSA各5 μl，去離子水29 μl)，反應(yīng)條件：37 ℃，4～8 h。PAX3雙酶切產(chǎn)物目的片段和pcDNA3.0-HA雙酶切載體片段在1%瓊脂糖凝膠中電泳跑膠驗(yàn)證，切膠回收、純化后連接，連接體系10 μl(目的片段PAX3 4 μl，載體片段pcDNA3.0-HA 2 μl，T4DNA連接酶1 μl，10×T4DNA連接酶Buffer 1 μl，去離子水2 μl)，反應(yīng)條件：16 ℃，連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板、篩選與擴(kuò)增后，挑選鑒定克隆。雙酶切連接產(chǎn)物經(jīng)電泳初步鑒定正確后DNA測(cè)序進(jìn)一步鑒定(武漢華大基因公司測(cè)序)。

1.2.1.2突變型PAX3基因重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-H80D-HA和pcDNA3.0-H186fs-HA的構(gòu)建 以pcDNA3.0-PAX3-HA為模板PCR擴(kuò)增H80D、H186fs突變型真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，利用在線(xiàn)軟件The QuikChange?Primer Design Program(https://www.genomics.agilent.com)在PAX3基因(GenBank accession no，NM181457.3)編碼區(qū)突變位點(diǎn)兩側(cè)分別設(shè)計(jì)兩對(duì)突變引物，H80D突變位點(diǎn)引物序列：上游5′-TGCGCGTGTCCGACGGCTGCGTC-3′；下游5′-GACGCAGCCGTCGGACACGCGCA-3′。H186fs突變位點(diǎn)引物序列：上游5′-AGGAA AGCGAGAAGAAGGCCAAAACAGCATCGACG-3′；下游：5′-CGTCGATGCTGTTTTGGCCTTCTTCTCGCTTTCCT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μl(pcDNA3.0-PAX3-HA 5 μl，5×HF Buffer 5 μl，dNTP 0.5 μl，Phusion超保真DNA聚合酶 0.5 μl，突變引物各1 μl，去離子水12 μl)，同時(shí)將不含引物的PCR反應(yīng)體系設(shè)為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件：98 ℃變性30 s后進(jìn)行循環(huán)，98 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，共循環(huán)25次，4 ℃保存。加入1 μl DpnⅠ內(nèi)切酶消化，37 ℃，過(guò)夜。酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板、篩選與擴(kuò)增后，挑選鑒定克隆。電泳初步鑒定正確后DNA測(cè)序進(jìn)一步鑒定(武漢華大基因公司測(cè)序)。上述構(gòu)建質(zhì)粒DNA測(cè)序鑒定正確后NucleSpin Plasmid Kit試劑盒抽提質(zhì)粒，分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒濃度，-20 ℃保存。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、接種和轉(zhuǎn)染 NIH3T3細(xì)胞用DMEM+10%FBS+1% Pen Strep培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前1天用胰酶消化細(xì)胞后均勻接種于24孔板或12孔板中，使每孔細(xì)胞密度達(dá)30%～40%。第二天細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)50%～60%時(shí)進(jìn)行脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，每轉(zhuǎn)染1 μg DNA需3 μl Lipfectamine 2000，加入Opti-MEM，6～8 h后吸盡加入新鮮DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3PAX3的核定位信號(hào)(nuclear localization signal,NLS)序列預(yù)測(cè) 應(yīng)用NLS預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)PAX3的NLS序列(http://cubic.bioc.columbia.edu/predict NLS/)。

1.2.4Western blot檢測(cè)野生型、突變型PAX3蛋白在NIH3T3細(xì)胞中的外源性表達(dá) 野生型PAX3及突變型H80D、H186fs質(zhì)粒分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞48 h后，吸盡12孔板中的DMEM。1×PBS清洗后每孔加入2×SDS上樣緩沖液80 μl(含Protease inhibitor cocktail 0.8μl和0.1 M PMSF 0.8 μl)，冰上裂解10 min，將貼壁細(xì)胞刮下后分別移至清潔EP管中。超聲破碎后，95 ℃煮沸變性10 min，冷卻至室溫。13 000 rpm，離心1 min，將上清移至新EP管內(nèi)，取10～15 μl上樣在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳跑膠(分離膠12%，濃縮膠5%)。轉(zhuǎn)膜后封閉、洗滌，加入一抗鼠抗HA單克隆抗體(1:2 000)，4 ℃過(guò)夜。洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1:10 000)，室溫1 h。ECL試劑盒顯色后曝光、顯影、成像。

1.2.5細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)野生型、突變型PAX3蛋白在NIH3T3細(xì)胞中的定位表達(dá) 轉(zhuǎn)染前1 d將NIH3T3細(xì)胞用胰酶消化后接種于加有滅菌圓形蓋玻片的24孔板中，使每孔細(xì)胞密度達(dá)10%～20%，野生型PAX3及突變型H80D、H186fs質(zhì)粒分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染48 h后，吸盡24孔板中的DMEM，1×PBS洗1次。每孔加入4%多聚甲醛室溫固定30 min后吸盡，1×PBS洗滌2次；每孔加入0.2% PBST(250 ml 1×PBS +500 μl Triton X-100 1×PBS)室溫透化30～60 min，吸盡；每孔加入200 μl PBSB(牛血清白蛋白+山羊血清+0.2% PBST)封閉60 min，吸盡。每孔加入單克隆鼠抗HA抗體(1:400)于4 ℃過(guò)夜。0.2%PBST洗3次后加入Cy2標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1:300)室溫避光孵育60 min。0.2%PBST洗3次后加入DAPI核染色2～3 min，吸盡后1×PBS洗滌3次；fluoromount G封片后激光共聚焦顯微鏡斷層掃描后照相保存。

2 結(jié)果

2.1PAX3的NLS序列預(yù)測(cè)結(jié)果 PAX3預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)PAX3的NLS序列發(fā)現(xiàn)PAX3有兩個(gè)NLS分別位于HD域的兩端。一個(gè)NLS序列是215LKRKQRR221，位于HD域的N端，另一個(gè)NLS序列是270RRARWRKQ277，位于HD域的C端(圖1)。

2.2PAX3基因重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-PAX3-HA的構(gòu)建 由于獲贈(zèng)質(zhì)粒pECE-PAX3沒(méi)有蛋白標(biāo)簽，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)其進(jìn)行改造與重組，以獲得具有蛋白標(biāo)簽的目的載體。利用分子克隆技術(shù)選擇EcoRⅠ/NotⅠ酶切位點(diǎn)將PAX3 cDNA從獲贈(zèng)質(zhì)粒中酶切后克隆到載體pcDNA3.0-HA上從而構(gòu)建了目的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-PAX3-HA，其中含有PAX3基因的全長(zhǎng)cDNA 1.44 kb。在pcDNA3.0-PAX3-HA中的PAX3 cDNA片段的5′端含有HA標(biāo)簽，這樣它編碼的蛋白的N端就帶有了HA標(biāo)簽(YPYDVPDYA)，可以被特異性抗HA抗體識(shí)別。

2.2.1由pECE-PAX3擴(kuò)增PAX3的電泳鑒定結(jié)果 PAX3基因cDNA全長(zhǎng)1.4 kb，PCR擴(kuò)增pECE-PAX3產(chǎn)物電泳出現(xiàn)1.44 kb大小條帶(圖2a)，與目的條帶PAX3大小符合。

2.2.2PAX3與pcDNA3.0-HA雙酶切電泳鑒定結(jié)果 pcDNA3.0-HA全長(zhǎng)5.4 kb，與純化回收的PCR擴(kuò)增PAX3產(chǎn)物雙酶切后電泳，分別獲得了5.4 kb片段和1.44 kb片段(圖2b)，與目的條帶pcDNA3.0-HA和PAX3大小符合。

2.2.3PAX3與pcDNA3.0-HA雙酶切產(chǎn)物連接后電泳鑒定結(jié)果 pcDNA3.0-PAX3-HA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板后挑選6個(gè)單克隆進(jìn)行雙酶切電泳鑒定，結(jié)果如圖2c所示，1～6道連接產(chǎn)物均被EcoRⅠ/ NotⅠ切開(kāi)，均獲得兩條5.4 kb和1.44 kb大小片段，分別與目的條帶pcDNA3.0-HA和PAX3大小符合。重組質(zhì)粒pcDNA3.0-PAX3-HA中插入的目的基因PAX3 cDNA序列與GenBank中的相應(yīng)登錄序列比對(duì)正確，說(shuō)明PAX3基因正確的插入到了質(zhì)粒pcDNA3.0-HA的EcoRⅠ和NotⅠ之間。

2.3PAX3基因突變真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-80D-HA和pcDNA3.0-186fs-HA的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pcDNA3.0-PAX3-HA中插入的目的基因PAX3 cDNA序列與GenBank中的相應(yīng)登錄序列比對(duì)正確后，以目的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-PAX3-HA為模板構(gòu)建H80D和H186fs突變型真核細(xì)胞表達(dá)載體，雙酶切初步鑒定正確后經(jīng)DNA測(cè)序鑒定突變位點(diǎn)的核苷酸序列均正確(圖3、4)，說(shuō)明pcDNA3.0-80D-HA和pcDNA3.0-186fs-HA構(gòu)建成功。

圖1 PAX3蛋白NLS序列預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-PAX3-HA的鑒定

a PAX3擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M：1kb DNA ladder marker， 1：PAX3產(chǎn)物；b PAX3和pcDNA3.0-HA的雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M：1kb DNA ladder marker，1：PAX3 2：pcDNA3.0-HA；c pcDNA3.0-PAX3-HA連接產(chǎn)物雙酶切電泳鑒定，M：1kb DNA ladder marker，1～6：pcDNA3.0-PAX3-HA雙酶切產(chǎn)物

圖3 突變型H80D與野生型PAX3的DNA測(cè)序峰圖 a：野生型PAX3 b：突變型H80D

圖4 突變型H186fs與野生型PAX3的DNA測(cè)序峰圖 a：野生型PAX3 b：突變型H186fs

2.4野生型及突變型PAX3蛋白在NIH3T3細(xì)胞中的外源性表達(dá) H80D(c.238C>G)是一錯(cuò)義突變，突變的PAX3基因的238位上的堿基C變?yōu)閴A基G，產(chǎn)生的突變蛋白的80位的組氨酸變成了天冬氨酸，但含有的氨基酸與野生PAX3蛋白相同，分子量仍為53 kDa。H186fs(c.556delC)是由于PAX3基因的556位缺失了堿基C，導(dǎo)致其后的核苷酸移位，編碼的蛋白在192位氨基酸出現(xiàn)終止密碼子，產(chǎn)生含有191個(gè)氨基酸的截?cái)嗟鞍?，最?個(gè)氨基酸由移碼的核苷酸編碼，分子量大小約21 kDa(圖5a)。

構(gòu)建成功的真核細(xì)胞表達(dá)載體中的目的基因可以在細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的蛋白，為了研究突變蛋白表達(dá)是否正常，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建的突變質(zhì)粒是否正確，利用Western blot對(duì)其在NIH3T3細(xì)胞中的外源性表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果野生PAX3蛋白和突變H80D、H186fs蛋白出現(xiàn)目的條帶，大小正確(圖5b)。

圖5 Western blot檢測(cè)野生型、突變型PAX3蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)

a：野生型、突變型PAX3蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，X后數(shù)字表示框碼移位的氨基酸的數(shù)量；b：野生型、突變型PAX3蛋白的表達(dá)

2.5野生型/突變型PAX3蛋白在NIH3T3細(xì)胞中的定位表達(dá) 為進(jìn)一步了解并研究2個(gè)PAX3突變蛋白的亞細(xì)胞定位，利用細(xì)胞免疫熒光對(duì)他們?cè)贜IH3T3細(xì)胞中的定位表達(dá)進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H80D突變蛋白和野生PAX3蛋白一樣只在細(xì)胞核中分布，而H186fs突變蛋白則出現(xiàn)異常亞細(xì)胞定位，在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有分布(圖6)。

圖6 野生型、突變型PAX3蛋白在NIH3T3細(xì)胞中定位(×1 200)

PAX3野生蛋白和H80D突變蛋白僅在細(xì)胞核內(nèi)分布，H186fs突變蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有分布。綠色：cy2染色，示野生PAX3蛋白(a)，H80D突變蛋白(d)，H186fs突變蛋白(g)；藍(lán)色：DAPI染色，示細(xì)胞核(b，e，h)；綠色和藍(lán)色疊加后的圖像(c，f，i)；WT：野生型(wild type)

3 討論

PAX3基因編碼的PAX3蛋白由479個(gè)氨基酸組成，主要含有配對(duì)盒結(jié)構(gòu)域(paired box domain，PD)、同源結(jié)構(gòu)域(homeodomain，HD)、高度保守的鋅肽序列和富含絲氨酸-蘇氨酸-脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation，TA)[2]，其分子量大小約53 kD。PAX3最早于NC遷徙前在背神經(jīng)管表達(dá)，后隨神經(jīng)管的發(fā)育逐漸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、關(guān)節(jié)、骨骼肌以及NC源性組織如周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)、心肌間質(zhì)、平滑肌、胸腺、腎上腺髓質(zhì)、皮膚毛發(fā)和內(nèi)耳的黑素細(xì)胞中廣泛表達(dá)。PAX3通過(guò)調(diào)節(jié)NC發(fā)育而參與胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，在骨骼肌及黑色素的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1，5]。在黑素細(xì)胞的發(fā)育中，PAX3主要通過(guò)直接或與其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用激活或抑制小眼球畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmiaassciated transcription factor,MITF)、多巴色素異構(gòu)酶(dopachrome tautomerase,DCT)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrosinase related protein 1,TRP1)的表達(dá)，參與調(diào)控黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育與分化，既能促進(jìn)也能抑制黑色素合成[1，6]。MITF、TRP1和DCT是黑素細(xì)胞發(fā)育和黑色素合成中的關(guān)鍵調(diào)控因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示黑素細(xì)胞發(fā)育不良會(huì)引起血管紋中黑素細(xì)胞源性的中間細(xì)胞缺乏進(jìn)而造成Corti器退化變性，最終導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾[7]。PAX3基因突變通過(guò)影響NC發(fā)育尤其是NC源性黑素細(xì)胞發(fā)育導(dǎo)致WS。

以轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的體外實(shí)驗(yàn)是研究突變對(duì)基因功能影響最常用的實(shí)驗(yàn)方法[6,8,9]，需要利用分子克隆技術(shù)將目的基因克隆到載體構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體后導(dǎo)入細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)在以野生型質(zhì)粒為模板構(gòu)建突變質(zhì)粒時(shí)應(yīng)用Phusion超保真DNA聚合酶較高效率地通過(guò)PCR將突變的cDNA片段擴(kuò)增出來(lái)。利用成功構(gòu)建的野生型和突變型PAX3真核細(xì)胞重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示野生PAX3、突變H80D和H186fs蛋白在NIH3T3細(xì)胞均正確表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了構(gòu)建的突變表達(dá)質(zhì)粒的正確性，也為下一步亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。盡管錯(cuò)義突變H80D未影響氨基酸合成數(shù)量，其翻譯成的突變蛋白與野生蛋白具有相同的多肽鏈，但80位氨基酸的改變可能使突變蛋白多肽鏈在構(gòu)象、極性等方面與野生蛋白出現(xiàn)差異而導(dǎo)致其蛋白功能的異常，有待進(jìn)一步研究。

PAX3蛋白是轉(zhuǎn)錄因子，屬于核蛋白，僅在細(xì)胞核中分布并行使其正常功能，在其氨基酸序列上擁有特異的核定位信號(hào)NLS，可以被相應(yīng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識(shí)別后通過(guò)細(xì)胞核膜上的核孔復(fù)合體(nuclear pore complex，NPC)進(jìn)入到細(xì)胞核，然后和靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。因此，正常的細(xì)胞分布是PAX3行使其正常的生理功能的前提條件，異常的細(xì)胞分布必然導(dǎo)致其功能的異常。PAX3蛋白的NLS序列還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究利用NLS預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)了PAX3的NLS序列(http://cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/)，發(fā)現(xiàn)PAX3有兩個(gè)NLS分別位于HD域的兩端。一個(gè)NLS序列是215LKRKQRR221，位于HD域的N端，另一個(gè)NLS序列是270RRARWR KQ277，位于HD域的C端。HD是PAX3蛋白與DNA結(jié)合以及與其他蛋白相互作用的重要功能域，由第220～277位共58個(gè)氨基酸組成。H80D突變蛋白的HD域及兩個(gè)NLS序列完整，可以被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識(shí)別并被轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)NPC進(jìn)入細(xì)胞核，所以其亞細(xì)胞定位與野生PAX3一樣。而H186fs突變蛋白失去了HD域和兩個(gè)NLS序列，成為大小約21 kDa的截?cái)嗟鞍?，可以通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散經(jīng)NPC進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，出現(xiàn)異常的亞細(xì)胞定位，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有分布，提示H186fs突變蛋白功能異常。

PAX3基因突變可導(dǎo)致PAX3蛋白功能的異常進(jìn)而影響黑素細(xì)胞發(fā)育，本研究初步顯示了基因突變對(duì)PAX3蛋白在細(xì)胞中分布的影響。但PAX3基因突變體H80D和H186fs如何影響PAX3對(duì)靶基因的調(diào)控導(dǎo)致國(guó)人WS的發(fā)病機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，本研究為其奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

1 Kubic JD, Young KP, Plummer RS, et al. Pigmentation PAX-ways: the role of Pax3 in melanogenesis, melanocyte stem cell maintenance, and disease[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2008,21:627.

2 Pingault V, Ente D, Dastot-Le Moal F, et al. Review and update of mutations causing Waardenburg syndrome[J]. Hum Mutat, 2010,31:391.

3 Kochhar A, Hildebrand MS， Smith RJ. Clinical aspects of hereditary hearing loss[J]. Genet Med, 2007,9:393.

4 Chen H, Jiang L, Xie Z, et al. Novel mutations of PAX3, MITF, and SOX10 genes in Chinese patients with type I or type II Waardenburg syndrome[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010,397:70.

5 Wu M, Li J, Engleka KA, et al. Persistent expression of Pax3 in the neural crest causes cleft palate and defective osteogenesis in mice[J]. J Clin Invest, 2008,118:2 076.

6 Lang D, Lu MM, Huang L, et al. Pax3 functions at a nodal point in melanocyte stem cell differentiation[J]. Nature, 2005,433:884.

7 Tachibana M, Kobayashi Y， Matsushima Y. Mouse models for four types of Waardenburg syndrome[J]. Pigment Cell Res, 2003,16:448.

8 Sanchez-Mejias A, Watanabe Y, Raquel MF, et al. Involvement of SOX10 in the pathogenesis of Hirschsprung disease: report of a truncating mutation in an isolated patient[J]. J Mol Med, 2010,88:507.

9 Corry GN， Underhill DA. Pax3 target gene recognition occurs through distinct modes that are differentially affected by disease-associated mutations[J]. Pigment Cell Res, 2005,18:427.