郭偉　馮江敏　孫立等

[摘要] 目的 觀察促紅細(xì)胞生成素（EPO）對慢性馬兜鈴酸腎?。–AAN）大鼠血管性假血友病因子（vWF）表達(dá)的影響，探討促紅細(xì)胞生成素對慢性馬兜鈴酸腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用。方法 雌性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分三組：①CAAN模型組，②EPO治療組，③正常對照組，每組各10只，關(guān)木通水煎劑灌胃12周制備CAAN大鼠模型。從第13周起，治療組大鼠給予皮下注射重組人EPO每次50 IU/kg，每周3次，共6周。第19周檢測各組大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、尿蛋白、血紅蛋白（Hb）、血vWF水平；免疫組化法檢測腎組織vWF的表達(dá)。結(jié)果 與CAAN組比較，EPO治療組BUN、SCr、尿蛋白水平、vWF水平下降，Hb水平升高 （均P<0.05）。同時EPO治療組大鼠腎組織vWF的表達(dá)減少（P<0.05）。 結(jié)論 EPO治療可以改善CAAN大鼠的腎功能，可能與其下調(diào)vWF，減輕內(nèi)皮損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 促紅細(xì)胞生成素；馬兜鈴酸；慢性；大鼠；血管性假血友病因子

[中圖分類號] R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）12-0008-03

[Abstract] Objective To observe the effect of erythropoietin on the expression of Von Willebrand factor（vWF） in CAAN rats and to investigate the protective effect of erythropoietin of kidney in rats with CAAN. Methods Thirty female Wistar rats were randomLy divided into 3 groups. ①CAAN group（n=10）； ②EPO group（n=10）； ③SHAM group（n=10）； CAAN group and EPO group were infused into stomachs with Caulis aristolochia manshuriensis decoction for 12 weeks. From week 13，EPO group were received EPO by hypodermic injection with 50 IU/kg three times a week for 6 weeks. At weeks 19，All the rats were killed. Specimens of blood and urine were collected to detect the blood urea nitrogen（BUN），Serum creatinie（Scr）， Haemato-globin（Hb），urine protein and levels of vWF. HE and Masson staining and micro-scopy were used to observe the pathology of the kidney. Immunohistochemistry were used to detect the expression of vWF. Results Urinary protein， serum creatinine and BUN and levels of vWF in EPO treated group were much lower than those of CAAN group； Hb was increased（both P<0.05）. The A value of vWF+ decreased in EPO treated group comparing to CAAN group（P<0.01）. Conclusion EPO could deduce the level of vWF and decreased thrombosis.

[Key words] Erythropoietin； Aristolochia acid； Chronic；Rat； Von Willebrand factor

馬兜鈴酸腎?。ˋrisolochic acid nephrapathy， AAN）是由于服用含有馬兜鈴酸（Arisolochic acid， AA）的中草藥所致的腎小管間質(zhì)疾病[1]。雖然對含 AA 中草藥的腎毒性認(rèn)識逐步提高，但研究報道顯示：在基層醫(yī)院含 AA 藥物的使用量仍在逐年增加。每年不斷出現(xiàn)新發(fā) AAN 病例快速進(jìn)展至終末期腎臟病（ESRD），給患者、家庭及政府帶來沉重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-3]。目前對AAN的治療尚無成熟方法。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是主要由腎臟分泌的多肽細(xì)胞因子，是紅細(xì)胞增殖、發(fā)育過程的重要調(diào)節(jié)因子[4]。隨著人們對 EPO 的生物學(xué)效應(yīng)不斷地深入研究，EPO的非造血作用引起巨大關(guān)注。Jungers 等[5]的回顧性研究發(fā)現(xiàn) EPO 可以顯著延緩慢性腎病的進(jìn)展。本研究擬觀察EPO對CAAN大鼠vWF表達(dá)的影響，探討EPO的腎臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

雌性Wistar大鼠30只，體重190～220 g。購自沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。關(guān)木通購自遼寧省中醫(yī)藥大學(xué)。人重組EPO由華北制藥金坦生物技術(shù)有限公司提供。Masson試劑盒購自福建邁新公司。兔抗大鼠vWF多克隆抗體購自丹麥Dako Cyto-mation公司、SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒、二抗生物素化羊抗兔IgG購自武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1 動物模型制備及分組 參照文獻(xiàn)[6]方法制備CAAN動物模型，關(guān)木通水煎劑灌胃12周，劑量20 g/（kg·d）相當(dāng)于10 mL/（kg·d），實(shí)驗(yàn)期間大鼠均自由飲食，飲水。雌性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為三組：CAAN模型組、EPO治療組、正常對照組，每組各10只，造模結(jié)束后，治療組大鼠予皮下注射重組人EPO每次50 IU/kg，每周3次，共6周。

1.2.2 血、尿生化指標(biāo)檢測 鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合法檢測24 h尿蛋白定量，全自動生化分析儀檢測血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）。ELISA法檢測外周血vWF含量。

1.2.3腎組織形態(tài)學(xué)檢查 腎組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定4 h，石蠟包埋，切取4 μm石蠟切片，HE和Masson染色，普通光鏡觀察。Masson染色纖維化區(qū)域染色呈蘭色，每張切片隨機(jī)選取10個不含腎小球的視野（400倍），用顯微圖象分析儀測定其纖維化區(qū)域的積分光密度值（A），代表腎間質(zhì)纖維化面積。

1.2.4 vWF免疫組織化學(xué)染色 4 μm石蠟切片依次經(jīng)脫蠟，水化及抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉非特異染色，滴加一抗兔抗vWF多克隆抗體，工作濃度為1∶500，PBS代替一抗為陰性對照。然后滴加二抗生物素化羊抗兔IgG，工作濃度為1∶150，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染；系列酒精脫水、透明、封片，鏡下觀察。用顯微圖象分析儀對圖像進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)選取10個高倍視野（400倍），測定其陽性物質(zhì)積分光密度（A）值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理，其中計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血、尿生化檢查結(jié)果

EPO組和CAAN組24 h尿蛋白定量、尿素氮和血肌酐、外周血vWF含量均較正常對照組明顯升高，Hb顯著下降；與CAAN組比較，EPO組24 h尿蛋白定量、尿素氮和血肌酐、外周血vWF含量均明顯降低，Hb有所升高（均P<0.05）。見表1。

2.3 vWF免疫組化染色結(jié)果

vWF染色陽性呈黃色或黃棕色細(xì)顆粒樣沉積在腎間質(zhì)。正常對照組vWF染色均為陰性，少數(shù)血管染色為弱陽性，呈淺黃色。CAAN組vWF陽性表達(dá)明顯增加，吸光值為（19.36±2.22）。EPO組vWF陽性表達(dá)較CAAN組減少，吸光值為（12.37±1.78）。見表2，封三圖3。

3 討論

近20年來，含有馬兜鈴酸成分的中草藥引起的腎臟損害受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。雖然近年來不斷有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究報告，但對于馬兜鈴酸腎病仍無成熟治療方案，尋求有效的預(yù)防及治療措施是目前醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。有研究報道馬兜鈴酸腎病在明顯的腎間質(zhì)纖維化之前，腎小管周圍毛細(xì)血管（PTC）已有明顯減少，且PTC減少的程度與腎間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)[7]。我們課題組前期研究[6，8]發(fā)現(xiàn)關(guān)木通致CAAN大鼠的腎間質(zhì)微血管數(shù)目明顯減少，微血管管壁玻璃樣變、斷裂，管腔閉塞。這些研究均證明腎間質(zhì)微血管病變是CAAN發(fā)生、發(fā)展重要機(jī)制。而血管內(nèi)皮損傷在腎臟微血管丟失中起重要作用。促紅細(xì)胞生成素是分子量34kDa的一種低分子糖蛋白，是重要的造血生成因子。近來研究表明EPO并不局限于作為紅細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，而且在抗凋亡、抗炎、抗氧化等方面發(fā)揮著積極作用[9]。在對急性大腦皮層缺血損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞EPO受體表達(dá)增加，提示EPO可能具有保護(hù)內(nèi)皮的作用，EPO可阻止低氧誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮損傷[10]。

基于以上機(jī)制，本研究復(fù)制CAAN動物模型給予EPO治療，治療組大鼠尿蛋白排泄量，尿素氮，血肌酐明顯減少，提示EPO治療可以改善CAAN大鼠的腎功能。我們發(fā)現(xiàn)CAAN大鼠血vWF水平顯著升高，腎組織vWF的陽性表達(dá)增加；治療組大鼠血vWF水平下降，腎組織vWF的陽性表達(dá)減少。vWF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成，并儲存在血管內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade小體中，在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后可參與血栓的形成[11]，因此vWF常被作為檢測內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)[12]。治療后vWF的顯著下降，說明EPO治療可以減輕CAAN大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。同時研究發(fā)現(xiàn)EPO治療組腎間質(zhì)纖維化區(qū)域較CAAN組明顯減小，我們推測EPO治療可以減少腎臟微血管的內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)而減少腎臟微血管的丟失，延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

綜上，EPO治療CAAN具有改善貧血以外的血管內(nèi)皮保護(hù)作用，為EPO治療CAAN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2014-01-15）

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（收稿日期：2014-01-15）