王素，趙衛(wèi)，胡繼紅，易根發(fā)，王滔

·實驗研究Experimental research·

經(jīng)皮穿刺脾靜脈栓塞建立繼發(fā)性脾功能亢進的動物模型和射頻消融治療研究

王素，趙衛(wèi)，胡繼紅，易根發(fā)，王滔

目的介紹一種快速建立的繼發(fā)性脾功能亢進（脾亢）的豬動物模型，并在此模型基礎(chǔ)上進行射頻消融治療（RFA）研究。方法在B型超聲或CT導(dǎo)向下經(jīng)皮穿刺豬脾靜脈主干并栓塞引起淤血性脾腫大，再進行RFA治療，觀察動物外周血細(xì)胞變化，了解脾臟影像學(xué)變化以及組織病理學(xué)改變。結(jié)果脾靜脈栓塞后1周外周血紅細(xì)胞、血小板即下降，第3周以后二者下降明顯（P＜0.05），紅細(xì)胞和血小板減少，脾腫大可持續(xù)6周以上。術(shù)后第2周起，脾臟組織學(xué)改變符合脾淤血改變。射頻熱能引起脾臟局部凝固壞死，脾內(nèi)血管閉塞、廣泛微血栓導(dǎo)致血栓性梗死形成。結(jié)論經(jīng)皮脾靜脈栓塞建立繼發(fā)性脾亢方法簡單、確切，可以作為脾亢外科或介入治療的較理想模型，RFA治療是一種有效的干預(yù)措施。

繼發(fā)性脾功能亢進；脾靜脈栓塞；射頻消融；動物模型；豬

肝硬化門靜脈高壓是臨床上常見的一種病癥，常合并脾腫大、脾功能亢進（脾亢）、腹水、食管胃底靜脈曲張及破裂出血；脾亢導(dǎo)致血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞的下降，并使病情進一步惡化，且妨礙抗病毒的治療。隨著對脾臟功能的進一步研究，脾臟的功能得到充分認(rèn)識及肯定；探索如何保留部分脾臟，有效控制脾亢，成為臨床面臨的重要課題。我們成功建立了一種快速、繼發(fā)性脾亢的動物模型，并對其進行脾亢射頻消融（RFA）治療，取得滿意結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象健康豬18頭（昆明醫(yī)科大學(xué)動物科提供），體重35～40 kg，雌雄不拘。

1.1.2 主要實驗試劑及設(shè)備鹽酸氯胺酮注射液2 m l∶0.1 g（由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)）、地西泮注射液2m l∶10 g、玻璃水柱、自制脾靜脈栓塞彈簧圈:將臨床廢棄的Cordis金屬導(dǎo)絲剪去頭尾，抽出內(nèi)芯后，將螺旋鋼絲緊密纏繞在不同直徑（6～10 mm）的鋼柱上乙醇燈加熱，去火后，塞入釋放器中，消毒備用。

B型超聲（EUB-5500 JAPAN）、平板DSA血管造影機（PHILLIPS FD-20荷蘭）、RFA-1型多極RFA系統(tǒng)及RFA-1315型多極RFA電極（北京博萊德光電技術(shù)有限公司），SOMATOM Emotion 16層面CT（德國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組18只動物隨機分為3組:Ⅰ組（正常組，未行栓塞，n=4），Ⅱ組（對照組，脾靜脈栓塞組，n=8），Ⅲ組（實驗組，脾亢模型行脾RFA，n=6）。

1.2.2 動物模型建立Ⅱ組、Ⅲ組實驗動物空腹過夜，用鹽酸氯胺酮（20 mg/kg）、地西泮（0.8 mg/kg）、阿托品（0.5～1 mg/只）肌內(nèi)注射全麻后，Ⅱ組、Ⅲ組實驗動物腹部備皮，常規(guī)消毒，建立靜脈通道，側(cè)臥并固定于平板DSA手術(shù)臺，B型超聲定位、導(dǎo)向下用千葉針或深靜脈留置針經(jīng)皮經(jīng)肝穿刺門靜脈右支（左側(cè)臥）一次成功后，透視下分別將兩條5 F單彎導(dǎo)管置于脾靜脈主干近門脈處（栓塞導(dǎo)管）及脾靜脈脾門區(qū)端（測壓導(dǎo)管），先行上述兩點測壓（玻璃水管法測門靜脈的壓力），通過栓塞導(dǎo)管用合適型號的自制彈簧圈進行脾靜脈主干栓塞（彈簧圈大小根據(jù)個體差異在6～10mm直徑內(nèi)選擇），通過測壓導(dǎo)管造影證實脾靜脈是否已被致密栓塞（栓塞前造影可見脾靜脈、門靜脈顯影完全，栓塞后造影見脾靜脈血流完全停滯認(rèn)為已達到致密栓塞），并進行栓塞后壓力測定；將兩導(dǎo)管撤出，穿刺點包扎后送回動物科飼養(yǎng)，溫度（24±2）℃，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2.3 RFA治療脾亢模型成功建立后（脾靜脈栓塞后第3周末），Ⅲ組空腹過夜，全麻（方法同前），腹部、腿部備皮在腿部粘貼電極護片。常規(guī)消毒鋪巾，在B型超聲引導(dǎo)下將RFA-1315型多極RFA電極插入脾臟，接上RFA-1型多極RFA系統(tǒng)（功率為0～300 W，溫度上限設(shè)為90℃），單次消融時間為20 min。RFA每燒灼1次后收針，后退2 cm，再將多極RFA針打開進行燒灼，直至脾包膜下，更換穿刺部位再插入脾臟內(nèi)對另一處（方法同前）進行RFA。退出電極前電凝針道防止出血。穿刺點包扎后送回動物科飼養(yǎng)，溫度（24±2）℃，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2.4 病理組織檢查?、窠M動物1只全麻（方法同前），手術(shù)切除脾臟并用4%甲醛固定制片作為標(biāo)準(zhǔn)對照，向靜脈注入50ml空氣處死動物。Ⅱ組動物術(shù)后第1到第6周末（以術(shù)后第1天算起）同法取脾臟病理標(biāo)本，每周末標(biāo)本取樣1只；Ⅲ組術(shù)后第1到3周末同法取脾臟病理標(biāo)本，每周末標(biāo)本取樣1只。

1.2.5 外周血細(xì)胞檢查3組動物在栓塞術(shù)前1周經(jīng)耳緣靜脈抽靜脈血2ml行血常規(guī)檢查，作為正常參考數(shù)據(jù)。Ⅱ組除做病理檢查動物外，在栓塞術(shù)后每周末經(jīng)耳緣靜脈抽靜脈血2 ml行血常規(guī)檢查，連續(xù)6周，結(jié)果作為對照組數(shù)據(jù)。Ⅲ組在栓塞術(shù)后第3周末經(jīng)耳緣靜脈抽靜脈血2 ml行血常規(guī)檢查，結(jié)果作為RFA術(shù)前數(shù)據(jù)。在脾臟RFA術(shù)后，除去做病理檢查的動物外，每周末經(jīng)耳緣靜脈抽靜脈血2m l行血常規(guī)檢查，連續(xù)6周，作為實驗組數(shù)據(jù)。

1.2.6 影像學(xué)檢查除去用作病理組織檢查的動物，分別對Ⅱ組和Ⅲ組動物每周末CT掃描了解脾臟增大情況，結(jié)合血常規(guī)結(jié)果，確定脾亢模型是否成功建立，并對RFA術(shù)后的脾臟變化進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS11.5軟件包。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后動物觀察

動物于脾靜脈栓塞和脾臟RFA后第1天即恢復(fù)正常飲水、進食，無煩躁、嘔吐、厭食等癥狀，體重?zé)o明顯變化，穿刺點無感染、出血，實驗動物全部存活。

2.2 門靜脈、脾靜脈壓力變化

栓塞前脾靜脈壓力（16.86±2.64）cmH2O，栓塞后脾靜脈壓力（30.49±4.71）cmH2O，栓塞前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；栓塞前門靜脈壓力（15.76±2.38）cmH2O，栓塞后門靜脈壓力（9.24± 1.81）cmH2O，栓塞前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 外周血細(xì)胞計數(shù)的變化

Ⅱ組、Ⅲ組第1、2、3、4、5、6周末RBC、PLT、WBC改變分別見表2、3，Ⅱ組RBC及PLT下降與Ⅰ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Ⅲ組RBC及PLT上升與Ⅱ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），WBC無明顯改變。

表1 脾靜脈栓塞前后脾靜脈、門靜脈壓力變化（±s）

表1 脾靜脈栓塞前后脾靜脈、門靜脈壓力變化（±s）

時間脾靜脈壓力/（cmH2O）門靜脈壓力/（cmH2O）栓塞前16.86±2.64 15.76±2.38栓塞后30.49±4.71 9.24±1.81 t值-7.132 6.175 P值＜0.01＜0.01

2.4 脾臟影像學(xué)表現(xiàn)

表2 脾靜脈栓塞后各周未動物外周血常規(guī)變化（±s）

表2 脾靜脈栓塞后各周未動物外周血常規(guī)變化（±s）

注:P值為與正常參考值比較

參數(shù)正常參考值1周2周3周4周5周6周RBC（×1012/L）7.91±0.76 7.03±0.69 6.59±0.45 6.30±0.51 6.40±0.27 6.49±0.36 6.58±0.27 P值-＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 PLT（×109/L）465±46 394±59 347±38 307±39 333±16 337±33 357±14 P值-＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 WBC（×109/L）23.04±4.33 24.76±5.73 23.86±3.68 24.40±2.08 23.79±1.75 23.71±1.10 23.49±1.17 P值-------

表3 脾臟RFA動物各周外周血常規(guī)變化（±s）

表3 脾臟RFA動物各周外周血常規(guī)變化（±s）

參數(shù)RFA術(shù)前1周2周3周4周5周6周RBC（×1012/L）6.21±0.51 6.98±0.4 7.21±0.49 7.55±0.47 7.18±0.4 7.21±0.49 7.55±0.47 P值-＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 PLT（×109/L）307±39 363±37 424±47 443±10 433±37 424±47 443±10 P值-＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 WBC（×109/L）23.04±4.33 24.76±5.73 23.86±3.68 24.40±2.08 23.79±1.75 23.71±1.10 23.49±1.17 P值-------

CT掃描提示脾靜脈栓塞后2周脾臟體積均明顯增大，可持續(xù)6周以上。Ⅲ組脾臟毀損病灶可見高密度的凝固性壞死區(qū)，其內(nèi)有片狀低密度氣體影，消融灶周圍條帶狀稍低密度影。

2.5 組織病理學(xué)表現(xiàn)（圖1、2）

圖1 RFA術(shù)前后血細(xì)胞變化曲線圖及栓塞前后脾靜脈、門靜脈壓力變化圖

與正常脾臟結(jié)構(gòu)相比，脾靜脈栓塞后2周末Ⅱ組脾臟明顯充血腫大，脾竇擴張，可見大量RBC破壞后形成的含鐵血黃素巨噬細(xì)胞；4～6周除脾竇擴張外，脾臟內(nèi)纖維組織增生，脾竇內(nèi)可見微血栓形成，脾小梁增粗，脾被膜增厚，脾靜脈內(nèi)有血栓形成。

Ⅲ組大網(wǎng)膜與脾臟RFA病灶表面粘連較嚴(yán)重，脾毀損病灶剖面外觀與CT影像學(xué)一致，包括磚黃色的干燥壞死區(qū)和血栓性梗死區(qū)。鏡下觀察，除射頻針穿刺點有脾內(nèi)出血外，未見明顯的脾內(nèi)出血。射頻熱能引起脾臟局部凝固壞死，脾內(nèi)血管閉塞、廣泛微血栓導(dǎo)致血栓性梗死形成。

3 討論

脾亢是由某些病因引起的脾臟病理性功能增強，循環(huán)血液中的有形成分不同程度減少的一組癥候群；分為原發(fā)性脾亢和繼發(fā)性脾亢，而繼發(fā)性脾亢最常見于肝硬化門脈高壓癥；其發(fā)病機制至今仍不清楚，主要有4種學(xué)說:脾內(nèi)阻留學(xué)說、體液抑制學(xué)說、自身免疫學(xué)說、稀釋學(xué)說［1-2］。其中被廣為接受的是脾內(nèi)阻留學(xué)說，其機制為長時間的被動淤血導(dǎo)動物脾臟和各期脾臟組織學(xué)改變致竇壁纖維組織和竇內(nèi)皮細(xì)胞增生，脾竇壁總面積和長度均增加，血細(xì)胞在脾內(nèi)過度阻留而被脾內(nèi)功能高度活躍的單核-巨噬細(xì)胞所吞噬，導(dǎo)致外周血中血細(xì)胞明顯減少。此外，慢性肝病引起的血小板生成素減少、肝炎病毒對骨髓造血前體細(xì)胞抑制、慢性失血以及血液稀釋等因素都不同程度地參與脾亢的發(fā)生［3］。

圖2 正常

隨著近年來深入研究，人們對脾臟功能有了新的認(rèn)識，脾臟具有強大的抗感染、抗腫瘤功能，在機體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；盡可能的保留部分脾功能，已成為共識［4-5］。采用微創(chuàng)方法減少脾臟體積，控制脾亢，改善血象，成為目前研究熱點［6］。

為對脾亢進行深入研究，建立脾亢的動物模型有重要意義，但臨床上脾亢是一個漫長而且復(fù)雜的過程，要建立與人類相似的脾亢動物模型極其困難，尤其對于可進行微創(chuàng)研究的大型動物；目前實驗動物有鼠、兔、犬及豬，方法采用藥物或手術(shù)操作［7］。

脾靜脈主干栓塞后，近脾門脾靜脈壓力增高，從而形成一個繼發(fā)性門靜脈高壓。我們研究發(fā)現(xiàn)脾靜脈主干栓塞后1周末，外周血RBC、PLT即下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；3周后RBC、PLT明顯減少，脾腫大可持續(xù)6周以上；說明本研究脾亢模型建立成功，可以作為脾亢外科或介入治療的理想模型。與2003年劉全達等［4］介紹的在外科結(jié)扎脾靜脈主干基礎(chǔ)上快速建立的繼發(fā)性脾亢犬動物模型及2007年程水兵等［5］通過外科手術(shù)縮窄脾靜脈主干制備的家兔繼發(fā)性脾亢模型結(jié)果基本一致，但方法更簡單，結(jié)果更確切。本研究中WBC的改變不明顯，其原因有待進一步研究，這與先前研究相似［4］。用脾靜脈介入栓塞制作脾亢模型，具有微創(chuàng)、成功率高的優(yōu)點，是脾亢模型制作的一種有效新方法。但脾切除術(shù)及部分性脾動脈栓塞（partial splenic embolization，PSE）是治療脾亢常用方法，仍存在很多問題尚待解決。高能聚焦超聲（high intensity focused ultrasound ablation，HIFU）、微波及經(jīng)皮脾內(nèi)注射無水乙醇等微創(chuàng)方法在脾功能亢進的研究亦才起步，仍有許多問題需要進一步的研究［8］。

RFA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療實質(zhì)臟器腫瘤，并取得良好的臨床效果。RFA是利用RFA儀，在影像系統(tǒng)導(dǎo)向下直接穿刺到脾臟，射頻電極發(fā)出中高頻射頻波，激發(fā)組織細(xì)胞進行等離子振蕩產(chǎn)生較高熱量，這不僅可使脾臟組織發(fā)生凝固性壞死，直接破壞靶區(qū)組織和血管，導(dǎo)致周圍更彌散的多葉段性脾血栓性梗死形成。射頻熱還可導(dǎo)致脾內(nèi)微血栓形成以及血管閉塞，血栓性梗死區(qū)逐漸被吸收，而殘余外觀“正常”脾組織結(jié)構(gòu)變致密，血管閉塞、大量膠原纖維沉積，這是脾臟RFA縮小的重要病理基礎(chǔ)。

理論上，RFA適用于門靜脈高壓性脾亢的治療:①脾臟是實質(zhì)臟器，熱毀損可使局部組織凝固壞死；②射頻熱能保持一定時間高溫，使局部血管和脾竇內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死、血栓形成、血管和脾竇閉塞；③脾臟穿刺安全，而且射頻的熱能有止血功效；④RFA使脾臟壞死后局部發(fā)生炎性反應(yīng)和新生毛細(xì)血管形成，建立廣泛的門-腔靜脈間側(cè)支循環(huán)，毀損后脾臟血液回流減少，降低門靜脈壓力。

我們在脾亢動物模型上進行RFA治療，并進行了6周血樣跟蹤檢測和3周RFA樣品切片制備及分析，確認(rèn)RFA術(shù)對于脾亢的治療有明顯的作用，可明顯改善脾亢所致的PLT、RBC減少，使其回升至栓塞術(shù)前水平，病理可見脾臟局部凝固壞死，脾內(nèi)血管閉塞、廣泛微血栓形成。本實驗動物對脾臟RFA耐受性好，無死亡以及胃腸穿孔、腹腔內(nèi)出血、脾臟破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生，說明B型超聲導(dǎo)向下經(jīng)皮穿刺豬的脾臟實施射頻局部定量消融是安全、可行的，為進一步的臨床研究提供了必要的資料。但是操作中必須注意:①穿刺點避開脾門和脾臟大血管；②穿刺后保持電極針固定，可減少出血；③為防止膈肌無菌性炎性反應(yīng)引起肺部并發(fā)癥和脾臟牽涉痛，選擇脾臟中下極作為RFA穿刺的首選部位。

綜上所述，脾靜脈栓塞術(shù)制作脾亢模型，微創(chuàng)、成功率高，是脾亢模型制作的一種有效新方法，RFA治療門靜脈高壓性脾大脾亢安全可行，近期療效顯著，是一種安全、可行的微創(chuàng)方法。然而由于本研究樣本量小，隨訪時間短，還需進一步加大樣本量，延長隨訪時間進行觀察。

［1］Mousa A，Armbruster J，Adongay J，et al.Splenic artery embolization as a treatment option for chronic pancytopenia secondary to hypersplenism:a case report and review of literature［J］.Vasc Endovascular Surg，2012，46:501-503.

［2］Shi B，Zhu H，Liu YJ，et al.Experimental studies and clinical experiences on treatment of secondary hypersplenism with extracorporeal high-intensity focused ultrasound［J］.Ultrasound Med Biol，2012，38:1911-1917.

［3］劉全達，馬寬生，何振平，等.射頻消融治療繼發(fā)性脾腫大、脾功能亢進可行性和安全性的實驗研究［J］.中華外科雜志，2003，40:62-65.

［4］劉全達，馬寬生，何振平，等.快速建立繼發(fā)性脾功能亢進的犬動物模型［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，25:301-304.

［5］程水兵，張啟瑜，楊文軍.脾靜脈主干縮窄法制備家兔繼發(fā)性脾功能亢進模型［J］.肝膽胰外科雜志，2007，19:79-81.

［6］Kawanaka H，Akahoshi T，Kinjo N，etal.Impactof antithrombinⅢconcentrates on portal vein thrombosis after splenectomy in patients with liver cirrhosis and hypersplenism［J］.Ann Surg，2010，251:76-83.

［7］Alzen G，Basedow J，Luedemann M，et al.Partial splenic embolization as an alternative to splenectomy in hypersplenism—single center experience in 16 years［J］.Klin Padiatr，2010，222:368-373.

［8］李趙鵬，趙衛(wèi).脾臟射頻消融治療門脈高壓性脾功能亢進的研究進展［J］.介入放射學(xué)雜志，2009，18:953-956.

The establishment of anim almodels w ith secondary hypersp lenism by using percutaneous embolism of sp lenic vein technique and the study on radiofrequency ablation

WANG Su，ZHAOWei，HU Ji-hong， YIGen-fa，WANG Tao.Intervention Section，Department of Medical Imaging，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，Yunnan Province 650032，China

HUJi-hong，E-mail:867404586@qq.com

ObjectiveTo introduce a method for fast establishment of pig models with secondary hypersplenism，and using this model to study the effect of radiofrequency ablation（RFA）.MethodsCongestive splenomegaly was created by CT-guided percutaneous embolization of splenic vein and its collateral branches in pigs.Then radiofrequency ablation was employed in themodels to observe the changes of peripheral blood as well as the spleen changes in itsmorphology and histopathology.The blood cell count for peripheral venous blood was determined once a week，and the spleen size wasmeasured by CT scanning. Results One week after splenic vein embolization，the counts of peripheral erythrocytes and platelets showed a reduction，which became more obvious in three weeks（P＜0.05）.Erythropenia，thrombocytopenia and sp lenomegaly could last for over six weeks.At the second week after the procedure，pathologically the spleen assumed passive congestion appearance.The thermal energy produced by radiofrequency ablation could cause local splenic coagulation necrosis，splenic vessels occlusion and splenic thrombotic infarction due to diffuse micro-vascular thrombosis.ConclusionTo establish an animal model with secondary hypersplenism，the method of CT-guided percutaneous embolism of sp lenic vein is simple and reliable.The animalmodels can be used for surgical or interventional researches.Radiofrequency ablation is an effective intervention means.（J Intervent Radiol，2014，23:792-796）

secondary hypersplenism；splenic vein embolization；radiofrequency ablation；animal model；pig

R551.1

B

1008-794X（2014）-09-0792-05

2014-02-09）

（本文編輯:侯虹魯）

10.3969/j.issn.1008-794X.2014.09.013

650031昆明昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科介入室

胡繼紅E-mail:867404586@qq.com