付丹丹

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000）

高原肺動(dòng)脈高壓大鼠重返平原后肺組織中5-HTT基因表達(dá)變化

付丹丹

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000）

目的探討高原肺動(dòng)脈高壓大鼠重返平原后肺組織中5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)變化。方法46只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組（C組，8只），高原低壓低氧組（H組，8只），重返平原組（R10組，R20組，R30組,每組10只），正常對照組大鼠置于平原常壓常氧處喂養(yǎng)，高原低壓低氧組和重返平原組置于模擬海拔5000米高原環(huán)境喂養(yǎng)建立肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型，重返平原組大鼠建立肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型后再于平原飼養(yǎng)，應(yīng)用RT-PCR方法檢測各組大鼠肺組織中5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)水平。結(jié)果與正常對照組（0.11±0.03）相比較，5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA在高原低壓低氧組表達(dá)明顯增高(0.92±0.03，P＜0.01)，重返平原組10 d，20 d組表達(dá)增高（0.57±0.02，0.38± 0.02，P＜0.01），隨重返平原時(shí)間的延長其表達(dá)量不斷下降，R30組表達(dá)無差異（0.14±0.04，P＞0.05）。結(jié)論5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因在高原低壓低氧環(huán)境中表達(dá)量明顯增高，重返平原后，5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)降低并逐漸恢復(fù)。

高原；肺動(dòng)脈高壓；5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；重返平原

高原肺動(dòng)脈高壓（High altitude pulmonary hypertension,HAPH）是高原地區(qū)的常見病、多發(fā)病，同時(shí)也是適應(yīng)生理的重要環(huán)節(jié)[1]，對高原人群的身體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，關(guān)于其具體發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡述，有關(guān)學(xué)者曾提出：“解決這一問題的唯一辦法就是將病人轉(zhuǎn)到低海拔地區(qū)”[2]。相關(guān)臨床及實(shí)驗(yàn)研究證明，在一定條件下5-羥色胺（5-HT）可以引起肺血管痙攣、收縮以及結(jié)構(gòu)的重塑，最終會引起肺動(dòng)脈高壓的形成，但發(fā)揮這種作用，需要通過5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（5-HTT）將5-HT轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)后才能充分發(fā)揮。本實(shí)驗(yàn)通過觀察高原低氧環(huán)境中肺動(dòng)脈高壓大鼠重返平原常壓常氧以后肺組織中5-HTTmRNA表達(dá)變化規(guī)律，現(xiàn)將報(bào)道如下。

1 材料與方法

清潔級Wistar雄性大鼠46只（購于蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），RT-PCR儀（MJ Research company, USA），凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP，GDS8000,USA），TRIzol試劑購于invitrogen公司，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒及2x Taq PCR MasterMix購自天根生化科技有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)、合成，低壓氧艙（中航工業(yè)貴州風(fēng)雷航空軍械公司研制）。

1.2 方法1）動(dòng)物的分組與處理方法：清潔級Wistar雄性大鼠46只，體重180～220 g,按體重隨機(jī)分為正常對照組（C組8只）、高原低壓低氧組（H組，8只）和重返平原組（R10，R20，R30,各10只）。C組置于平原處喂養(yǎng)30 d，H組和R組飼養(yǎng)于低壓氧艙中模擬海拔5000米環(huán)境30 d,每天22 h（出艙2 h,打掃清潔喂食），R組再于平原處喂養(yǎng)10 d,20 d和30 d時(shí)，各取10只處理。2）標(biāo)本的取材與處理方法：用20%烏拉坦5 ml/kg腹腔內(nèi)注射，麻醉大鼠后置于動(dòng)物手術(shù)臺上，然后放血處死大鼠，取大鼠左側(cè)下肺葉組織，以蒸餾水快速?zèng)_洗肺組織，然后置于液氮中速凍，-80℃凍存?zhèn)溆谩?）引物的設(shè)計(jì)與合成：以大鼠5-HTTmRNA序列為模板，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。5-HTT上游引物為：5'-GCTACAACAAGTTCAACAACAAC-3'，下游引物為：5'-GCCACCTCTGACACATCTTC-3'；內(nèi)參照18S上游引物為：5'-TCACTGAGGATGAGGTGGAACG-3'，下游引物：5'-TCAGTCGCTCCAGGTCTTCACG-3'。5-HTT及18S PCR產(chǎn)物預(yù)期片段的長度分別為180和148 bp。4）5-HTT mRNA的檢測：精確稱取凍存的大鼠肺組織100 mg，按照TRIzol一步抽提法提取細(xì)胞總RNA，按照20μL體系逆轉(zhuǎn)錄，25μL體系擴(kuò)增。按照下列條件及方法進(jìn)行目的基因擴(kuò)增：預(yù)變性94℃3 min,變性94℃30s,退火30s（溫度58℃18s，5-HTT 62℃），延伸72℃1min，循環(huán)33次。按不同循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物的圖像分析，證實(shí)上述循環(huán)參數(shù)基本使PCR擴(kuò)增在指數(shù)期內(nèi)，模板量與循環(huán)數(shù)經(jīng)檢測均在線性范圍內(nèi)，72℃終末延伸5分鐘后終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物6 ul，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件分析處理，以18S作為內(nèi)參照(見圖1）計(jì)算5-HTT mRNA的相對表達(dá)量。

圖1 18S mRNA

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件，對各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。本實(shí)驗(yàn)為計(jì)量資料數(shù)據(jù)。多組間比較應(yīng)用方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，正常對照組、高原低壓低氧組和重返平原組大鼠肺組織中均見5-HTT mRNA表達(dá)。C組5-HTT mRNA表達(dá)量為0.12± 0.02，H組5-HTT mRNA表達(dá)量為0.92±0.03，R10組5-HTT mRNA表達(dá)量為0.57±0.02，R20組5-HTT mRNA表達(dá)量為0.38±0.02，R30組5-HTT mRNA表達(dá)量為0.14±0.04。與正常對照組相比較，高原低壓低氧組肺組織中5-HTT mRNA表達(dá)明顯增高（P＜0.01）。重返平原組于10 d,20 d時(shí)，其表達(dá)水平則較C組5-HTT mRNA表達(dá)量為表達(dá)增加（P＜0.01），但30 d時(shí)與正常對照組比較其表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05),重返平原組內(nèi)比較均有差異（P＜0.01）。見圖2。

圖2 5-HTT mRNA

3 討論

在高原上，機(jī)體在適應(yīng)環(huán)境的過程中，高原性的肺動(dòng)脈高壓是其中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，同時(shí)，其也是一系列的高原性疾病的重要發(fā)生基礎(chǔ)，例如高原性的紅細(xì)胞增多癥、肺水腫、心臟病等，是一種潛在發(fā)生的高原性疾病病程的早期階段，該疾病有很復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前臨床上對其仍然沒有好的治療。

5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體屬于一種膜蛋白，它可作為轉(zhuǎn)載體在5-羥色胺內(nèi)化入細(xì)胞時(shí)起到重要作用，在血管平滑肌增殖反應(yīng)中起一定的作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在模擬的海拔五千米的環(huán)境中生活了一個(gè)月以后，其肺組織中5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體信使RNA的表達(dá)明顯發(fā)生上調(diào)，這個(gè)結(jié)果與MacLean等人檢測的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)增加（在低氧的條件下，應(yīng)用肺血管平滑肌細(xì)胞獲得）相符合[3]。本實(shí)驗(yàn)是在模擬的高原低壓、低氧環(huán)境下，在大鼠肺組織整體的角度上證實(shí)，5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)是增高的。

曾有相關(guān)的資料指出，在平原上曾經(jīng)生活著的人群當(dāng)移居到高原上生活時(shí)，人群便逐漸的發(fā)生了肺動(dòng)脈性的高壓（與高原上的長期的低氧、低壓的生活環(huán)境密切相關(guān)）；當(dāng)這些人群再返回到了平原之后，由于他們離開了高原的低氧、低壓的環(huán)境，他們的肺動(dòng)脈高壓逐漸發(fā)生改善，有些人群則逐步恢復(fù)了正常4]，但這類資料的樣本偏低。我們的實(shí)驗(yàn)通過研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在重返平原后，5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體信使RNA在各個(gè)時(shí)間段組都有相應(yīng)的表達(dá)，但這些表達(dá)在各組間都有明顯的差異，隨著返回平原的時(shí)間的延長，它的表達(dá)水平也發(fā)生逐步的降低。由此證明，機(jī)體由高原轉(zhuǎn)回平原環(huán)境生活以后，隨時(shí)間的增加，會對平原環(huán)境慢慢的發(fā)生獲得性的適應(yīng)，在大鼠的肺組織中的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體信使RNA的表達(dá)也會下降，并可逐漸恢復(fù)至正常。

[1]Ge Rili,Peter Hackett.Life on the Qinghai-Tibetan plateau[J].Peking University Medical Press,2007,(7):100-110.

[2]Xu XQ,Jing ZC.High-altitude pulmonary hypertension[J].Eur Respir Rev,2009,18(111):13-17.

[3]李雪芹,李運(yùn)景.肺動(dòng)脈高壓的5-羥色胺/5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體機(jī)制研究進(jìn)展[J].國際呼吸雜志,2010,30（2）：119-121.

[4]袁慧,魏連忠.超聲檢測由高原返回內(nèi)地居住居民的肺動(dòng)脈改變[J].華西醫(yī)學(xué),2008,23(4)：823.

R544.16

A

1008-4118（2014）03-0013-02

10.3969/j.issn.1008-4118.2014.03.05

2014-06-10