張慶華,姬素霞,胡金花,閆麗,張鵬,胡建和,徐彥召

（1.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)康大消毒劑有限公司,河南新鄉(xiāng)453000）

不同環(huán)境下二氧化氯消毒劑的消毒效果及其穩(wěn)定性研究

張慶華1,姬素霞1,胡金花2,閆麗2,張鵬2,胡建和1,徐彥召1

（1.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)康大消毒劑有限公司,河南新鄉(xiāng)453000）

為了研究不同環(huán)境下二氧化氯的消毒效果及其穩(wěn)定性,試驗(yàn)以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌為測試菌株,采用菌懸液定量殺菌試驗(yàn)、壓縮霧化法和平板計(jì)數(shù)的方法,對二氧化氯的殺菌效果進(jìn)行試驗(yàn).結(jié)果表明：在菌液密度為5×106CFU/mL的條件下,90 mg/L的二氧化氯作用5 min,即可對測試菌株達(dá)到100%的殺滅效果.不同的pH值、溫度及不同濃度有機(jī)物存在的條件下,二氧化氯同樣具有極強(qiáng)的消毒效果.霧化的二氧化氯對空氣自然菌及霧化菌液氣溶膠的殺滅效果同樣可以達(dá)到100%.試驗(yàn)表明二氧化氯作為一種高效、穩(wěn)定的廣譜消毒劑具有良好的殺菌效果.

二氧化氯；消毒劑；消毒效果；穩(wěn)定性

二氧化氯由于其廣譜、高效的殺菌能力,被公認(rèn)是當(dāng)今國際上含氯類消毒劑產(chǎn)品中唯一高效的消毒殺菌劑[1-2].在較低的質(zhì)量濃度下,二氧化氯短時間內(nèi)即可殺滅絕大多數(shù)的微生物,包括細(xì)菌芽孢、繁殖體、分歧桿菌、真菌和病毒等[3].二氧化氯是通過對細(xì)菌細(xì)胞壁較強(qiáng)的吸附穿透能力而進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),其極強(qiáng)的氧化能力可以有效的氧化細(xì)胞內(nèi)含有巰基的生物酶,使其失去生物活性,并可以迅速的抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白的代謝、合成,從而引起微生物的死亡[4].不僅可以殺滅細(xì)菌,二氧化氯還具有除臭、保鮮、抗霉、防腐、漂白及氯化等多方面的作用,因此被廣泛的應(yīng)用于多個領(lǐng)域[5-7].研究表明,二氧化氯對高等生物的體細(xì)胞無致畸、致癌、致突變作用,且與有機(jī)物的氧化降解產(chǎn)物,被證明對生物體十分安全,無毒副作用[8].因此二氧化氯也是被世界衛(wèi)生組織（WHO）定義為A1級的安全消毒劑.由于臨床使用環(huán)境的多樣性以及人們對其殺菌效果認(rèn)識的不確切,二氧化氯在實(shí)際使用過程中存在著不合理使用的現(xiàn)象.本文就不同環(huán)境下二氧化氯對常見致病菌的最低有效殺菌濃度及其穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,希望對二氧化氯的合理使用提供科學(xué)的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,ATCC 8099菌株；大腸桿菌（Escherichia coli）,ATCC 6538菌株；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）,ATCC 9372菌株；白色念珠菌（Monilia albican）,ATCC 10231菌株.以上菌株均購自南京便珍生物科技有限公司.胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖、葡萄糖、PBS、胎牛血清均購自Solarbio公司.二氧化氯消毒劑（有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%）由新鄉(xiāng)康大消毒劑公司提供.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 定性殺菌試驗(yàn)參照《消毒技術(shù)規(guī)范》（2008）,將制備好的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),然后用0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋為菌落密度5×105～5×106CFU/mL的菌液.10支中號試管排列于試管架上,依次編號1-10.每管添加無菌蒸餾水2.5mL,放20℃水浴中.于第1管加消毒液原液2.5mL,混勻后,由第1管取2.5mL至第2管,混勻后再從第2管吸2.5 mL至第3管,以此類推,直至第9管,混勻后取出2.5 mL棄去,第10管不加消毒藥液作為陽性對照.以每0.5 min加一管的速度加菌液2.5 mL于每支試管內(nèi),混勻,第9管不加菌液為陰性對照.加菌液后的5、10、15、30、60 min時,每管各取0.5 mL加入含足量中和劑（質(zhì)量濃度為5‰的硫代硫酸鈉）的4.5 mL液體培養(yǎng)基中,搖勻,中和10 min,再取出0.5 mL加入4.5 mL液體培養(yǎng)基內(nèi).將接種細(xì)菌的培養(yǎng)基管,置37℃培養(yǎng)48 h,若發(fā)生混濁即表示有細(xì)菌生長.必要時,可移植到固體培養(yǎng)基上,觀察菌落形態(tài),或進(jìn)行涂片染色鏡檢,以判斷生長的是否為試驗(yàn)菌,以排除污染.若肉湯不變混濁,應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至第7天,若仍不混濁方可判為無菌生長.

1.2.2 定量殺菌試驗(yàn)將制備的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),然后用0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋成菌落密度為106～107CFU/mL的試驗(yàn)菌液.吸取0.5 mL消毒劑溶液滴加于4.5 mL不同濃度的消毒劑溶液內(nèi).以0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液代替消毒液,同時進(jìn)行上述各步驟,作為對照組.置20℃水浴中作用5 min.立即吸取上述菌藥混合液1.0 mL,加入9.0 mL中和液中混勻.中和10 min后吸取0.2 mL菌藥混合液進(jìn)行涂板計(jì)數(shù),37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù).試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值.

1.2.3 pH值對二氧化氯殺菌效果的影響新鮮配制90 mg/L的二氧化氯消毒劑4.5 mL盛于中號試管并置于20℃恒溫水浴鍋內(nèi),分別調(diào)整pH值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0.將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌懸液分別稀釋至菌落濃度為106CFU/mL,每支試管添加稀釋后菌液0.5 mL.同時設(shè)加菌不用消毒劑的陰性對照、不加菌液不用消毒劑的陽性對照.于使用消毒劑后10 min取水樣1.0 mL,加入到9.0 mL質(zhì)量濃度為5‰的硫代硫酸鈉溶液中混勻,中和10 min后吸取0.2 mL菌藥混合液進(jìn)行涂板計(jì)數(shù),37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù).試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值.

1.2.4 溫度對二氧化氯殺菌效果的影響新鮮配制的90 mg/L二氧化氯消毒劑4.5 mL盛于5支中號試管分別置于恒溫水浴鍋內(nèi),分別調(diào)整水浴鍋溫度為0℃、10℃、20℃、30℃、40℃.1.2.3所述稀釋的菌液,每支試管添加0.5 mL.同時設(shè)加菌不用消毒劑的陰性對照、不加菌液不用消毒劑的空白對照.于使用消毒劑后10 min取水樣1.0 mL,加入到9.0 mL質(zhì)量濃度為5‰的硫代硫酸鈉溶液中混勻,中和10 min后吸取0.2 mL菌藥混合液進(jìn)行涂板計(jì)數(shù),37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù).試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值.

1.2.5 有機(jī)物對二氧化氯殺菌效果的影響蒸餾水分別配制胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%的溶液,并添加固體二氧化氯至質(zhì)量濃度為90 mg/L消毒劑溶液.取4支無菌中號試管,每管添加4.5 mL不同有機(jī)物濃度的消毒劑溶液,于恒溫鍋中20℃水浴.取1.2.3所述稀釋濃度的菌液,每支試管添加0.5 mL.同時設(shè)加菌不用消毒劑的陰性對照、不加菌液不用消毒劑的空白對照.于使用消毒劑后10 min取水樣1.0 mL,加入到9.0 mL質(zhì)量濃度為5‰的硫代硫酸鈉溶液中混勻,中和10 min后吸取0.2 mL菌藥混合液進(jìn)行涂板計(jì)數(shù),37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù).試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值.

1.2.6 二氧化氯對空氣中細(xì)菌的消毒試驗(yàn)于兩個相同的空間,一作試驗(yàn)（噴灑或蒸發(fā)消毒劑）,一作對照（以噴灑空氣或水代替消毒劑）,同時用同法采樣、培養(yǎng).記錄試驗(yàn)時溫度和相對濕度.采用平板沉降法采樣.采樣方法、位置、次數(shù)、間隔時間、采樣時間等,試驗(yàn)前后、試驗(yàn)組和對照組均完全一致.空氣消毒殺菌率Pt按式（1）計(jì)算.

式（1）中Nt=（V0－Vt）/V0.Nt為空氣細(xì)菌自始至t時的自然消亡（沉降和死亡）率.V0和V0,分別為對照組及試驗(yàn)組處理前空氣含菌量.Vt和Vt,分別為對照組及試驗(yàn)組處理后空氣含菌量.

將測試的4種細(xì)菌菌液用壓縮式霧化器噴成氣溶膠,霧化顆粒在10μm以下,空氣含菌量5×104CFU/m3左右.霧化噴菌10 min后開始采樣,檢測處理前空氣細(xì)菌含量,立即對試驗(yàn)空間進(jìn)行空氣消毒,同時設(shè)空氣或水對照.然后同樣采樣培養(yǎng).記錄試驗(yàn)時的溫濕度.同上統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 二氧化氯定性、定量殺菌結(jié)果

二氧化氯的最低有效殺菌濃度與時間的能效關(guān)系及定量殺菌數(shù)據(jù)見表1和表2.

表1 二氧化氯定性殺菌試驗(yàn)Tab.1 The qualitative germicidal test of chlorine dioxide

表2 二氧化氯對4種測試細(xì)菌定量殺菌試驗(yàn)Tab.2 Quantitative germicidal rest of chlorine dioxide to the tested strains%

由表1、表2可知,作用時間為5 min時,二氧化氯對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的最低有效殺菌質(zhì)量濃度分別為90 mg/L、180 mg/L、90 mg/L、90 mg/L、180 mg/L.處理時間大于等于30 min時,二氧化氯即可達(dá)到最大的殺滅效果.

2.2 不同pH值、溫度和血清體積分?jǐn)?shù)對二氧化氯消毒效果的影響

不同環(huán)境條件下,二氧化氯的殺菌效果見表3、表4、表5.

表3 不同pH值下二氧化氯的消毒效果Tab.3 Disinfection effect of chlorine dioxide in different pHCFU/mL

表4 不同溫度下二氧化氯消毒效果Tab.4 Disinfection effect of chlorine dioxide in different temperatureCFU/mL

表5 不同血清體積分?jǐn)?shù)下二氧化氯消毒效果Tab.5 Disinfection effect of chlorine dioxide in different concentrate of serumCFU/mL

試驗(yàn)結(jié)果表明,pH值在2～10的范圍內(nèi),90 mg/L的二氧化氯對測試細(xì)菌的細(xì)菌殺菌效果均達(dá)到100%（表3）.溫度在0～40℃的范圍內(nèi),90 mg/L的二氧化氯對測試細(xì)菌的細(xì)菌殺菌效果均達(dá)到100%（表4）.在血清體積分?jǐn)?shù)為5%～20%的范圍內(nèi),90 mg/L的二氧化氯對測試細(xì)菌的細(xì)菌殺菌效果均達(dá)到100%.即pH值、溫度和有機(jī)物對二氧化氯的消毒效果幾乎無影響（表5）.

2.3 二氧化氯對空氣消毒的殺菌效果

二氧化氯對空氣中自然菌及特定細(xì)菌氣溶膠的殺菌效果見表6和表7.

表6 二氧化氯對空氣自然菌消毒的殺菌率Tab.6 Sterilizing rate of chlorine dioxide to natural air

表7 二氧化氯對空氣中特定細(xì)菌的殺菌效果Tab.7 Disinfection of chlorine dioxide to aerosol of tested bacteria

由表6可知,空氣自然菌的噴水對照組和消毒前菌落數(shù)分別為56和54.對空氣中霧化噴灑濃度90 mg/L的二氧化對空氣自然菌的殺菌率為96.30%.由表7可知,采用自然沉降法采集霧化后空氣中的菌落數(shù)目,霧化90 mg/L的二氧化氯消毒,作用20 min后,二氧化氯對4種測試菌株的殺菌率均為100%.

3 結(jié)論與討論

從對4種常見致病菌的殺滅效果可以看出：當(dāng)消毒劑作用時間為20 min時,11.25 mg/L的二氧化氯即可殺滅水體中90%的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌,全部殺滅細(xì)菌的質(zhì)量濃度在45～90 mg/L.不同pH值、溫度及血清不同體積分?jǐn)?shù)對二氧化氯的殺菌效果沒有影響.當(dāng)室溫20℃、消毒劑作用時間為20 min時,90 mg/L的二氧化氯霧化20 min后對空氣中自然菌的殺菌率達(dá)到96.30%,對空氣中特定大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌氣溶膠的殺菌率均為100%.黃曉波等研究表明,給藥量在117 mg/kg（體質(zhì)量）條件下,二氧化氯對大鼠的體質(zhì)量、血常規(guī)及血液生物化學(xué)等指標(biāo)無異常變化,與陰性對照組比較均無顯著差異,病理檢查亦無顯著差異[9].李淑琴等在兔多次完整皮膚刺激試驗(yàn)中,穩(wěn)定性二氧化氯在含量為1 996.5 mg/L的質(zhì)量濃度下多次接觸動物完整皮膚末引起動物皮膚刺激反應(yīng),屬于無刺激性物質(zhì)；在亞急性毒性試驗(yàn)中,動物經(jīng)過30 d喂養(yǎng)后,試驗(yàn)各劑量組實(shí)驗(yàn)動物體重增加正常,生長發(fā)育良好,與正常對照組相比差異無顯著性[10].綜合本試驗(yàn)結(jié)果表明,二氧化氯消毒劑作為一種廣譜、高效、安全的殺毒劑,在臨床使用過程中不易受環(huán)境因素影響,對動物體刺激性較小具有良好的生物安全性.以90 mg/L為二氧化氯的正常使用質(zhì)量濃度,即可對水體、墻面及空氣中的細(xì)菌起到很好的殺菌效果.

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The research of disinfectant effect and stabilization of chlorine dioxide antiseptic in different environments

Zhang Qinghua1,Ji Suxia1,Hu Jinhua2,Yan Li2,Zhang Peng2,Hu Jianhe1,Xu Yanzhao1
（1.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China；2.Xinxiang Kangda disinfectant Co.,Ltd.,Xinxiang 453003,China）

To research the disinfetant effect and stabilization of chlorine dioxide in different environments,the antibacterial activity of chlorine dioxide to Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis and Manidia albican was tested by quantitative germicidal test,compression atomizing effect and plate counting method.The results showed that chlorine dioxide at 90 mg/L could kill all the bacteria in 5 min.Chlorine dioxide exhibits widely antiseptic properties in multi-environment,despite of the pH value,temperature and organic matter.Chlorine dioxide in gaseous also had the forceful sterilizing effect to the normal air and the theaerosol of bacterial suspension.It indicated that chlorine dioxide with the quality of efficient and stable have the excellent antibacterial activity as an disinfectant.

chlorine dioxide；disinfectant；efficacy of disinfection；stabilization

TP386

A

1008-7516（2014）04-0062-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.04.015

2014-05-20

張慶華（1988-）,男,河南開封人,碩士研究生.主要從事動物微生物學(xué)研究.

徐彥召（1984-）,男,河南許昌人,講師.主要從事動物微生物學(xué)、免疫學(xué)研究.

（責(zé)任編輯：盧奇）