孫雙燕,李東方,張團(tuán),張勝利

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

小麥SOD基因的電子克隆及生物信息學(xué)分析

孫雙燕,李東方,張團(tuán),張勝利

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

以NCBI中的EST數(shù)據(jù)庫(kù)為主要數(shù)據(jù)來(lái)源,以一系列生物信息學(xué)軟件為工具,進(jìn)行了超氧化物歧化酶（SOD）基因的電子克隆及生物信息學(xué)分析.結(jié)果表明：通過(guò)電子克隆方法獲得了SOD基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)序列,該預(yù)測(cè)的SOD蛋白質(zhì)氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中同類(lèi)基因的蛋白質(zhì)氨基酸序列具有極高的相似性,并且含有完整的保守結(jié)構(gòu)域；電子克隆到的SOD基因編碼的不是分泌蛋白,也不是膜蛋白,而是胞質(zhì)蛋白.通過(guò)某個(gè)基因的一個(gè)EST序列采用電子克隆的手段進(jìn)行基因全長(zhǎng)的電子拼接是可行的.

SOD基因；電子克??；小麥

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是一種源于生命體的活性物質(zhì),能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量的超氧自由基類(lèi)有害物質(zhì).SOD具有防止小麥細(xì)胞膜過(guò)氧化功能,在小麥干旱、寒冷、貧瘠、病害等逆境環(huán)境下含量會(huì)增加,對(duì)小麥正常生長(zhǎng)起保護(hù)作用.因此,SOD基因的克隆對(duì)于小麥SOD相關(guān)的逆境抗性機(jī)理研究具有重要的理論意義[1],對(duì)小麥分子育種也具有一定的參考價(jià)值.研究還發(fā)現(xiàn), SOD能影響小麥花藥的育性[2].對(duì)于小麥來(lái)說(shuō),其龐大的基因組（約17 G,是人類(lèi)基因組的5倍多）、異源多倍體（異源六倍體）使功能基因克隆非常困難.隨著高通量二代測(cè)序技術(shù)的不斷成熟與廣泛應(yīng)用,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、EST測(cè)序等累積了海量的DNA序列數(shù)據(jù),這為進(jìn)行基因的電子克隆提供了豐富的DNA數(shù)據(jù)[3-4].本研究以NCBI中的EST數(shù)據(jù)庫(kù)為主要數(shù)據(jù)來(lái)源,采用與前人類(lèi)似的方法進(jìn)行了小麥SOD基因的電子克隆研究.

1 材料與方法

以在GenBank中登錄號(hào)為JQ230561.1的小麥SOD基因EST（長(zhǎng)度為472 bp）為種子序列,以NCBI中的EST數(shù)據(jù)庫(kù)為主要數(shù)據(jù)源[5-6],采用類(lèi)似張德禮等[7]的方法進(jìn)行了SOD基因的電子克隆,并利用BlastP[8]、ORF finder[9]、clustalX1.8等軟件對(duì)該基因進(jìn)行同源比對(duì)、開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)等,利用ExPASy[10]生物信息學(xué)資源網(wǎng)站上的ProtParam、SOPMA、TMHMM、Phobius、SignalP等軟件對(duì)該基因進(jìn)行了蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋、信號(hào)肽等相關(guān)生物信息學(xué)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD基因的cDNA序列電子拼接結(jié)果

經(jīng)電子拼接得到的SOD基因的cDNA長(zhǎng)為906 bp,ORF finder預(yù)測(cè)結(jié)果表明,ORF區(qū)從213 bp到890 bp,長(zhǎng)678 bp,編碼225個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖1）.以預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度為225個(gè)氨基酸的蛋白為query,在CDD-42589 PSSMs蛋白保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索[11].結(jié)果表明：該預(yù)測(cè)的SOD蛋白質(zhì)氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中同類(lèi)基因的蛋白質(zhì)氨基酸序列具有極高的相似性,并且含有完整的保守結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖2）.因此,本研究電子拼接出來(lái)的SOD基因應(yīng)該含有其編碼區(qū)全長(zhǎng),但需要通過(guò)RT-PCR、RACE等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證.

圖1 電子克隆的SOD基因的開(kāi)放閱讀框Fig.1 Open reading frame of the in silicon cloning gene SOD

圖2 電子克隆的SOD基因的保守結(jié)構(gòu)域檢索結(jié)果Fig.2 Conserved domain search results of in silicon cloning gene SOD

2.2 不同植物中SOD同源蛋白質(zhì)序列比較分析

SOD基因蛋白序列與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)blastp比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1.

由表1的Blastp比對(duì)結(jié)果可知,電子克隆的SOD基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中小麥、大麥、二穗短柄草、高粱、玉米、水稻、番茄、馬鈴薯、擬南芥等植物中的SOD基因具有較高的同源性,蛋白序列覆蓋度在98%以上,序列一致性在75%～98%之間.單子葉植物與雙子葉植物中極高的序列相似性的事實(shí)表明,SOD基因是植物中普遍存在的一個(gè)逆境抗性相關(guān)基因,與不同植物對(duì)干旱、寒冷、貧瘠、病害等的抗性或適應(yīng)性密切相關(guān).電子拼接及同源分析研究結(jié)果也證明,通過(guò)某個(gè)基因的一個(gè)EST序列采用電子克隆的手段進(jìn)行基因全長(zhǎng)的電子拼接是可行的.二穗短柄草、水稻等基因組較小的模式生物中功能基因組學(xué)的研究比較深入,也克隆了大量功能基因,本研究為利用這些近緣物種的基因序列進(jìn)行基因組龐大的小麥功能基因的克隆提供了重要參考.

表1 SOD基因蛋白序列與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)blastp比對(duì)結(jié)果Tab.1 The result of blastp between SOD amino acid and the protein database of NCBI

2.3 SOD預(yù)測(cè)蛋白的生物信息相關(guān)分析

利用ProtParam程序?qū)OD預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析.結(jié)果表明：該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為24 601.0 Da,等電點(diǎn)（PI）為7.14；負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)與正電荷殘基（Arg+Lys）相同,均為24,分子式為C1119H1731N301O319S3；在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞（體外）中的半衰期是30 h；不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為28.59,表明該蛋白比較穩(wěn)定；平均疏水性（grand average of hydropathicity）為-0.265,表明該蛋白為親水蛋白.

SOPMA軟件對(duì)SOD預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：該蛋白質(zhì)含α螺旋（Alpha helix）107個(gè),占47.56%；含β片層（Beta sheet）39個(gè),占17.33%；含轉(zhuǎn)角（turn）16個(gè),占7.11%；含卷曲（coil）63個(gè),占28%.應(yīng)用TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果表明：本研究電子拼接的SOD蛋白不是跨膜蛋白,沒(méi)有跨膜螺旋.利用Phobius、SignalP等軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),證明該SOD蛋白不含有信號(hào)肽.上述預(yù)測(cè)結(jié)果暗示,本研究電子克隆到的SOD基因編碼的不是分泌蛋白,也不是膜蛋白,而是胞質(zhì)蛋白.

3 討論

植物基因克隆有多種方法,常用的有圖位克隆法、同源序列法、突變體篩選法、差異篩選法等[3].不同方法各有其優(yōu)缺點(diǎn),在克隆基因時(shí)應(yīng)根據(jù)被克隆基因的特點(diǎn)、供體基因組大小、遺傳圖譜和物理圖譜的完備性等選擇使用.由于小麥具有巨大的基因組,對(duì)其進(jìn)行基因克隆及驗(yàn)證相當(dāng)困難,因此,從事小麥分子生物學(xué)相關(guān)研究的學(xué)者們都在積極探索小麥基因克隆的快速有效方法.隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的不斷完善與廣泛應(yīng)用[12],包括EST序列在內(nèi)的基因表達(dá)序列數(shù)據(jù)日益膨脹[13],這為進(jìn)行基因的電子克隆提供了十分豐富的數(shù)據(jù).前人在電子克隆方面已經(jīng)做了大量的工作[4,7],為開(kāi)展此類(lèi)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

與RACE等其他技術(shù)相比,電子克隆具有簡(jiǎn)便﹑快速﹑節(jié)省經(jīng)費(fèi)等優(yōu)點(diǎn),如張德禮等[7]利用電子克隆結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法成功克隆了人類(lèi)新基因C17ORF2的cDNA（GenBank登錄號(hào)：AY074907和BK000260）,黃新杰[4]利用此法克隆到了3個(gè)小麥條銹病相關(guān)抗性基因等.本研究采用與前人類(lèi)似的方法進(jìn)行了小麥SOD基因的電子克隆,克隆到了SOD基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)序列,該預(yù)測(cè)的SOD蛋白質(zhì)氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中同類(lèi)基因的蛋白質(zhì)氨基酸序列具有極高的相似性,并且含有完整的保守結(jié)構(gòu)域,這為進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段克隆該基因奠定了良好基礎(chǔ),也為探索小麥逆境抗耐性基因快速克隆方法提供了一定參考.

[1]李娟,楊立新,鄭文寅,等.小麥FeSOD基因的克隆與序列分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2013,27（8）：1111-1117.

[2]李莉,張改生,張龍雨,等.小麥生理型與遺傳型雄性不育相關(guān)基因錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）及果糖1,6-二磷酸醛縮酶（FBA）的表達(dá)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,20（3）：225-234.

[3]喬納森·佩夫斯納.生物信息學(xué)與功能基因組學(xué)[M].孫之榮,譯.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2006.

[4]黃新杰.三個(gè)小麥抗條銹病相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及生物信息學(xué)分析[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.

[5]Boguski M S,Lowe T M,Tolstoshev C M.dbEST-database for“expressed sequence tags”[J].Nature Genetics,1993,4（4）：332-333.

[6]dbSTS：database of“Sequence Tagged Sites”.[2014-06-10].http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbSTS/.

[7]張德禮,孫曉靜,凌倫獎(jiǎng),等.人類(lèi)SR蛋白超家族新成員-SFRS12（SRrp508）的基因克隆和特性分析[J].遺傳學(xué)報(bào),2002,29（5）：377-383.

[8]Altschul S F,Madden T L,Sch ffer A A,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Research,1997,25：3389-3402.

[9]ORF Finder[DB/OL].[2014-06-10].http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html.

[10]SIB Bioinformatics Resource Portal[DB/OL].[2014-06-10].http：//www.expasy.org/proteomics.

[11]Marchler-Bauer A,Lu S,Anderson J B,et al.CDD：a conserved domain database for the functional annotation of proteins[J]. Nucleic Acids Research,2011,39：225-229.

[12]Wicker T,Taudien S,Houben A,et al.A whole-genome snapshot of 454 sequences exposes the composition of the barley genome and provides evidence for parallel evolution of genome size in wheat and barley[J].Plant Journal,2009,59（5）：712-722.

[13]Gunaratne P H,Coarfa C,Soibam B,et al.miRNA data analysis：next-gen sequencing[J].Methods in Molecular Biology,2012,822：273-288.

（責(zé)任編輯：鄧天福）

Genes in silico cloning and bioinformatics analysis of SOD in common wheat

Sun Shuangyan,Li Dongfang,Zhang Tuan,Zhang Shengli
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Taking EST database in the NCBI as the main data source,with a series of bioinformatics software as tools,the SOD gene in silico cloning and bioinformatics analysis was been done.The results showed that obtained SOD genes coding region of full-length sequence through in silico cloning.The prediction amino acid sequence of SOD protein has a very high sequence similarity with the protein amino acid of similarity genes in the protein database of NCBI,and contains a complete conservative domain structure.The encoding protein of SOD gene obtained in this study by in silico cloning is not secreted proteins,membrane protein,but the cytoplasmic protein.Gene full-length stitching of encoding region is feasible by means of in silico cloning through a relative EST sequence.

superoxide dismutase gene；in silico cloning；wheat

S512

A

1008-7516（2014）04-0007-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.04.002

2014-06-16

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201310467068）

孫雙燕（1990-）,女,河南周口人.

張勝利（1976-）,男,河北雞澤人,博士,副教授.主要從事植物分子生物學(xué)研究.