周次利,吳璐一,竇傳字,劉慧榮,馮輝,崔云華,馬曉芃,趙琛,吳煥淦

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;2.上海中醫(yī)藥研究院,上海 201203)

艾灸生成物對(duì)大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)的影響

周次利1,吳璐一2,竇傳字1,劉慧榮1,馮輝2,崔云華1,馬曉芃1,趙琛2,吳煥淦1

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;2.上海中醫(yī)藥研究院,上海 201203)

目的 觀察不同濃度艾灸生成物對(duì)SD大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)的影響。方法 將40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復(fù)組。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組,艾灸生成物與純凈氣的濃度比分別為 0.4：2.0、0.8：2.0、1.6：2.0,每天暴露 4 h,每星期5次,持續(xù)60 d;高劑量艾灸生成物恢復(fù)組經(jīng)60 d高劑量艾灸生成物刺激后,在空氣中自然暴露21 d作為恢復(fù)期。正常對(duì)照組大鼠不進(jìn)行任何艾灸生成物干預(yù),常規(guī)飼養(yǎng) 60 d。光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠大腦皮層、海馬、小腦病理形態(tài),透射電鏡下觀察海馬超微形態(tài)。結(jié)果 各組大鼠大腦皮層、海馬、小腦細(xì)胞病理形態(tài)無(wú)明顯差異,海馬超微結(jié)構(gòu)形態(tài)無(wú)明顯差異。結(jié)論 艾灸生成物對(duì)大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)無(wú)明顯影響。

艾灸生成物;安全性;腦神經(jīng)系統(tǒng);形態(tài)學(xué);大鼠

灸法最早記載于《左傳》,至今已有數(shù)千年的歷史,是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法。灸法以艾為主要施灸材料,施灸過(guò)程中產(chǎn)生艾煙等艾灸生成物。自古就有運(yùn)用艾葉煙熏治療和預(yù)防疾病的記載[1-2]。近年來(lái),隨著人們環(huán)保及健康安全意識(shí)的提高,艾煙等艾灸生成物的安全性逐漸成為灸法研究中亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題[3]。本研究觀察不同濃度艾灸生成物對(duì)SD大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠40只,雄性,由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,體重為(160±20)g。

1.2 主要試劑與儀器

艾條(南陽(yáng)市臥龍漢醫(yī)艾絨廠),HOPE-MED8053B燃煙動(dòng)式基礎(chǔ)染毒設(shè)備(天津合普公司),8050-1型動(dòng)靜洗三合一染毒柜(天津合普公司),組織包埋機(jī)(LEICA),石蠟切片機(jī)(LEICA公),LKB-Ⅰ型超薄切片機(jī)(LEICA),醫(yī)用冷藏箱(海爾),OLYMPUS BX53顯微鏡(OLYMPUS),OLYMPUS cellSens Dimension圖像分析系統(tǒng)(OLYMPUS),PHILIPS CM-120透射電鏡(PHILIP)。

1.3 分組

40只大鼠隨機(jī)分為5組,即正常對(duì)照組、低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復(fù)組,每組8只。

1.4 艾灸生成物干預(yù)

艾條以3：1出品率的1級(jí)精制3年陳艾絨作為原材料,參照衛(wèi)生部清艾條制作標(biāo)準(zhǔn)(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十七冊(cè))制成,每根艾條重25 g,長(zhǎng)20 cm,直徑2 cm,以桑皮紙包裹,由南陽(yáng)市臥龍漢醫(yī)艾絨廠提供。

在HOPE-MED8053B燃煙動(dòng)式基礎(chǔ)染毒設(shè)備中點(diǎn)燃艾條,通過(guò)調(diào)節(jié)混合氣(艾灸生成物)與純凈氣的濃度比,控制不同組別大鼠的艾灸生成物刺激濃度。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組,混合氣與純凈氣的濃度比分別為 0.4：2.0、0.8：2.0、1.6：2.0。

低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復(fù)組大鼠分別置于8050-1型動(dòng)靜洗三合一染毒柜中,按不同濃度每天暴露4 h,每星期5 次,持續(xù)60 d;高劑量艾灸生成物恢復(fù)組經(jīng)60 d高劑量艾灸生成物刺激后,在空氣中自然暴露21 d作為恢復(fù)期。正常對(duì)照組大鼠不進(jìn)行任何艾灸生成物干預(yù),常規(guī)飼養(yǎng)。

企業(yè)也可以只針對(duì)一種產(chǎn)品進(jìn)行調(diào)查，考察顧客滿意度的變化指數(shù)，這就是顧客滿意度。利用讓渡價(jià)值公式計(jì)算顧客滿意度；當(dāng)顧客滿意度小于0時(shí)，表明顧客不滿意；顧客滿意度大于0時(shí)，表明顧客滿意；如果兩者的差值太大，就表示顧客非常滿意。企業(yè)可以根據(jù)上述的公式，定期做一些市場(chǎng)推廣和調(diào)查問(wèn)卷，通過(guò)對(duì)顧客的滿意度調(diào)查調(diào)整公司的服務(wù)。在市場(chǎng)營(yíng)銷時(shí)可以根據(jù)顧客對(duì)購(gòu)買商品的要求，提供相應(yīng)的服務(wù)。如果顧客買到滿意的產(chǎn)品，就會(huì)表現(xiàn)與購(gòu)買前不一樣的狀態(tài)。企業(yè)也可以從不同的角度去觀察顧客在購(gòu)買產(chǎn)品的服務(wù)過(guò)程是否達(dá)到預(yù)期的效果，分析出他們所需要的產(chǎn)品和服務(wù)[4]。

1.5 取材與指標(biāo)檢測(cè)

60 d艾灸生成物干預(yù)結(jié)束后,正常對(duì)照組、低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組大鼠稱重,按體重以 3%戊巴比妥鈉 0.1 mL/ 100 g足量麻醉大鼠,斷頭取腦,迅速分離大腦皮層、海馬、小腦。左側(cè)海馬、大腦皮層、小腦置于4%多聚甲醛溶液后固定不超過(guò)24 h,石蠟包埋、切片,備用。右側(cè)海馬置于2.5%戊二醛中,備用。

21 d恢復(fù)期結(jié)束后,高劑量艾灸生成物恢復(fù)組按上述方法同樣取材。

1.5.1 光學(xué)顯微鏡觀察

HE染色行大鼠腦組織光學(xué)顯微鏡觀察,步驟如下。

切片常規(guī)脫蠟至水,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min,100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min;雙蒸水5 min×2;蘇木素3 min;自來(lái)水沖洗10 min;鹽酸乙醇3 s;流水10 min;伊紅1 min。梯度乙醇上行脫水,70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇各30 s。二甲苯透明,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min;中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織,拍片。

1.5.2 透射電鏡觀察

將固定好的標(biāo)本用 0.1 M磷酸漂洗液漂洗15 min×3,1%餓酸固定液固定2～3 h,0.1 M磷酸漂洗液漂洗15 min×3。4℃冰箱內(nèi)50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇90%丙酮(1：1)、90%丙酮各15～20 min脫水后,室溫100%丙酮脫水15～20 min×3。室溫純丙酮＋包埋液(2：1)浸透3～4 h后,室溫純丙酮＋包埋液(1：2)過(guò)夜,37℃純包埋液浸透2～3 h。37℃過(guò)夜、45℃12 h、60℃24 h以固化標(biāo)本。切片,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,PHILIPS CM-120透射電鏡觀察,拍片。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化

如圖 1所示,正常對(duì)照組大鼠大腦皮層層次結(jié)構(gòu)清晰,錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、梭形細(xì)胞等神經(jīng)元清晰可見(jiàn),結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,層次緊密,輪廓清晰,染色均勻,未見(jiàn)神經(jīng)元變性、壞死。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復(fù)組大鼠大腦皮層病理形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。

圖1 各組大鼠大腦皮層病理形態(tài)學(xué)變化(標(biāo)尺=20 μm)

如圖2所示,正常對(duì)照組大鼠海馬層次結(jié)構(gòu)清晰,錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等神經(jīng)元清晰可見(jiàn),結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,層次緊密,輪廓清晰,染色均勻,未見(jiàn)神經(jīng)元變性、壞死。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復(fù)組大鼠海馬病理形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。

圖2 各組大鼠海馬病理形態(tài)學(xué)變化(標(biāo)尺=20 μm)

如圖3所示,正常對(duì)照組大鼠小腦層次結(jié)構(gòu)清晰,顆粒細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞等神經(jīng)元清晰可見(jiàn),結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,層次緊密,輪廓清晰,染色均勻,未見(jiàn)神經(jīng)元變性、壞死。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復(fù)組大鼠小腦病理形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。

圖3 各組大鼠小腦病理形態(tài)學(xué)變化(標(biāo)尺=20 μm)

2.2 透射電鏡觀察

如圖4所示,正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元核圓,染色質(zhì)淺,核仁與核膜孔明顯可見(jiàn),細(xì)胞質(zhì)線粒體數(shù)量不多,卵圓形或短管狀,板層嵴粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與游離核糖體豐富,高爾基器位于核周,有少量脂褐素,微管和神經(jīng)絲可辨。低劑量艾灸生成物組、中劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物組、高劑量艾灸生成物恢復(fù)組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。

圖4 各組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化(標(biāo)尺=1 μm)

3 討論

艾煙等艾灸生成物的安全性評(píng)價(jià)是近年來(lái)灸法研究的熱點(diǎn)。艾煙等艾灸生成物是否對(duì)機(jī)體與環(huán)境產(chǎn)生不良影響是影響灸法發(fā)展的重要因素?；瘜W(xué)研究顯示,艾煙中既含有對(duì)人體有益的成分,亦含有可能對(duì)人體不利的成分[4]。Wheeler等[5]報(bào)道,在正常條件下,艾煙揮發(fā)性物質(zhì)和CO含量均不會(huì)導(dǎo)致安全危害;艾煙的檢測(cè)結(jié)果與城市環(huán)境中報(bào)告結(jié)果基本水平相當(dāng);極端情況下,艾條燃燒產(chǎn)生的艾煙中,只有丙烯醛、對(duì)苯二酚2種揮發(fā)性物質(zhì)水平和CO水平等于或大于安全接觸水平。黃茶熙等[6]監(jiān)測(cè)并分析京津地區(qū)夏季艾灸診室和灸療館內(nèi)可吸入顆粒物(PM10),顯示京津地區(qū)艾灸場(chǎng)所內(nèi)存在以艾燃燒生成物為主要來(lái)源的可吸入顆粒物(PM10)污染,艾灸場(chǎng)所內(nèi)PM10的平均質(zhì)量濃度(3.54 mg/m3)超過(guò)醫(yī)院候診室衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB9671-1996)中規(guī)定的最高限值(0.15 mg/m3),同時(shí)也超過(guò)同時(shí)間段北京市和天津市大氣PM10質(zhì)量濃度的月平均值(0.92 mg/m3和0.83 mg/m3)。目前,尚未見(jiàn)大樣本的艾灸生成物流行病學(xué)調(diào)查研究報(bào)告。Park等[7]檢索Web of Science、Cochrane Central Register of Controlled Trials等14個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)文獻(xiàn),系統(tǒng)評(píng)價(jià)艾灸的不良事件,顯示艾煙可引起少數(shù)有慢性咽炎病史的患者對(duì)艾灸煙霧過(guò)敏發(fā)生咳嗽,通風(fēng)后改善;少數(shù)患者發(fā)生艾灸過(guò)敏,停灸或抗過(guò)敏治療后過(guò)敏癥狀、體征消失。蘭蕾等[8]以SD大鼠為試驗(yàn)對(duì)象,進(jìn)行艾煙的急性毒理試驗(yàn),結(jié)果表明艾煙對(duì)大鼠的半數(shù)致死濃度LC50為11117 mg/m3,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)得出艾煙的毒性分級(jí)為微毒。

新近研究表明艾煙具有一定機(jī)體保護(hù)作用和細(xì)胞毒作用。一定濃度和時(shí)間的艾煙可提高快速老化小鼠血清及大腦抗氧化能力,減少自由基代謝產(chǎn)物,增強(qiáng)自由基清除能力,從而起到顯著的抗衰老作用[9-10]。艾煙和/或艾燃燒灰燼水提取物可選擇性對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用,抑制鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞Raw264.7一氧化氮和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá),具有抗癌和抗炎潛力,可成為治療腫瘤和炎癥的新型佐劑[11-16]。劉平等[17]報(bào)道不同濃度艾煙干預(yù)6個(gè)月(20 min/d)對(duì)大鼠外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞及CD3+CD4+/CD3+CD8+無(wú)影響,但可下調(diào)CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例,艾煙預(yù)處理可能通過(guò)該途徑發(fā)揮對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用,增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤作用。胡海等[18-19]報(bào)道艾煙冷凝物對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549形態(tài)、數(shù)量、活性及凋亡呈濃度依賴性或時(shí)間濃度依賴性,0.12 g/L濃度的艾煙冷凝物作用于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549 12 h后可顯著提高細(xì)胞存活率。韓麗等[20]研究顯示艾煙冷凝物具有潛在的遺傳毒性,尚未發(fā)現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系?？梢?jiàn),艾煙等艾灸生成物對(duì)機(jī)體作用的安全性與刺激濃度、刺激時(shí)間有一定相關(guān)性。

腦是機(jī)體重要的生命中樞。大腦皮層、海馬、小腦與機(jī)體學(xué)習(xí)和語(yǔ)言等高級(jí)認(rèn)知功能,軀體感覺(jué),聽(tīng)覺(jué),嗅覺(jué),視覺(jué),記憶,情感,運(yùn)動(dòng)控制等密切相關(guān)。崔瑩雪等[21]報(bào)道艾煙可影響快速老化模型小鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸表達(dá),認(rèn)為艾煙可通過(guò)調(diào)整腦內(nèi)氨基酸的異常代謝達(dá)到抗衰老的效應(yīng)。本研究中,我們采用透射電鏡觀察各組大鼠海馬超微形態(tài),光學(xué)顯微鏡觀察大腦皮層、海馬、小腦形態(tài),探討不同濃度艾灸生成物對(duì)SD大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果表明各組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)形態(tài)無(wú)明顯差異,大腦皮層、海馬、小腦細(xì)胞病理形態(tài)無(wú)明顯差異,顯示本研究艾灸生成物濃度與干預(yù)時(shí)間對(duì)大鼠腦神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)無(wú)明顯影響。蘭蕾等[22]研究結(jié)果亦顯示不同濃度艾煙對(duì)大鼠腦組織形態(tài)無(wú)明顯毒性作用,與本研究結(jié)果一致。

今后的研究中,可進(jìn)一步探討艾灸生成物不同刺激方式對(duì)機(jī)體各器官、組織、細(xì)胞、蛋白、基因、代謝產(chǎn)物等的結(jié)構(gòu)和功能的影響,開(kāi)展艾灸生成物接觸者流行病學(xué)調(diào)查,從而獲取艾灸生成物安全性范圍,制定艾灸生成物安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),促進(jìn)灸法的臨床應(yīng)用與推廣,推動(dòng)灸法的傳承與創(chuàng)新。

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Effect of Moxibustion-produced Substances on the Morphology of the Nervous System in Rat Brain

ZHOU Ci-li1, WU Lu-yi2,DOU Chuan-zi1, LIU Hui-rong1, FENG Hui2, CUI Yun-hua1, MA Xiao-peng1, ZHAO Chen2, WU Huan-gan1.
1.Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China; 2.Shanghai Academy o f Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

O bjective To i nvestigate th e e ffects o f d ifferent c oncentrations o f m oxibustion-produced s ubstances on the m orphology of t he nervous system in S D r at brain.MethodForty r ats w ere r andomly al located t o normal c ontrol, low-dose moxibustion-producedsubstances,middle-dose moxibustion-produced substances,high-dose moxibustion-produced substances and high-dose moxibustion-produced substances restoration groups. The concentration ratio of moxibustion-produced substances to pure air was 0.4:2.0 in t he l ow-dose m oxibustion-produced s ubstances g roup, 0.8:2.0 in th e m iddle-dose m oxibustionproduced substances group and 1.6:2.0 in the high-dose moxibustion-produced substances group. These three groups were exposed 4 hrs daily, 5 times a week, for 60 consecutive days. The high-dose moxibustion-produced substances restoration group was stimulated with high-dose moxibustion-produced substances for 60 days and then exposed to air for 21 days as a restoration stage. The normal control group of rats was not treated with any moxibustion-produced substances and routinely fed for 60 days. The pathological forms o f cer ebral co rtex, hippocampi and cerebella were obs erved by opt ical m icroscopy a nd hippocampal ultrastructures, by transmission e lectron microscopy in e very g roup of r ats.ResultThere were n o s tatistically s ignificant d ifferences i n t he pathological forms of cerebral cortex, hippocampi and cerebella, and hippocampal ultrastructures between various groups of rats.ConclusionMoxibustion-produced substances have no marked effect on the morphology of the nervous system in rat brain.

Moxibustion-produced substances; Safety; The nervous system in the brain; Morphology; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.06.0495

1005-0957(2014)06-0495-04

2014-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102637);上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃項(xiàng)目(SZY11067);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2009CB522900)

周次利(1980 - ),女,助理研究員,博士,研究方向?yàn)榘鞍纳晌锇踩栽u(píng)價(jià)與針灸治療胃腸疾病的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mail： zhoucili2010@126.com

趙琛(1973 - ),女,主任醫(yī)師,E-mail：chris_0127@126.com