AtchyB基因過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因洋桔?？寡趸缘挠绊?/h1>
2014-06-05 14:36:24楊海蘭武衛(wèi)黨
季 靜，楊海蘭，王 罡，武衛(wèi)黨，金 超，吳 疆
(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 天津大學(xué)遺傳工程研究所，天津 300072)
AtchyB基因過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因洋桔?？寡趸缘挠绊?/p>
季 靜1,2，楊海蘭1,2，王 罡1,2，武衛(wèi)黨1，金 超2，吳 疆1,2
(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 天津大學(xué)遺傳工程研究所，天津 300072)
由轉(zhuǎn)β-胡蘿卜羥化酶(AtchyB)基因的洋桔梗獲得T1代轉(zhuǎn)基因系，經(jīng)PCR及northern blot技術(shù)檢測(cè)后，對(duì)L8和 L25兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系及野生對(duì)照進(jìn)行 UV-B紫外脅迫處理．檢測(cè)脅迫前后植株的類胡蘿卜素、氧化酶(SOD、POD、CAT)和 MDA及光合作用相關(guān)參數(shù)值．對(duì)比結(jié)果表明：① 脅迫使得基因表達(dá)水平強(qiáng)化，轉(zhuǎn)基因系中與抗氧化性相關(guān)類胡蘿卜素顯著高于對(duì)照，葉黃素循環(huán)池顯著放大；② 酶促系統(tǒng)對(duì)非酶促系統(tǒng)產(chǎn)生影響，使得轉(zhuǎn)基因系與對(duì)照間的酶活力存在差異，和對(duì)照比，轉(zhuǎn)基因系的SOD對(duì)紫外脅迫更敏感，但MDA無(wú)顯著差異，這可能是兩種系統(tǒng)協(xié)調(diào)作用的結(jié)果；③ 脅迫后，轉(zhuǎn)基因系 Fv/Fm和 ΦPSⅡ值顯著高于對(duì)照，體現(xiàn)出其更強(qiáng)的抗氧化性．qP值顯示AtchyB基因過(guò)表達(dá)對(duì)洋桔梗光化學(xué)猝滅影響不大，其中L25的NPQ顯著高于對(duì)照，可見(jiàn)其非光化學(xué)淬滅能力有所提高．
轉(zhuǎn)基因洋桔梗；AtchyB基因；類胡蘿卜素；抗氧化性；光合作用
非生物脅迫包括溫度、干旱、鹽分、重金屬及輻射等，嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[1]．隨著臭氧層的破壞，紫外-B(UV-B，280～315,nm)的輻射對(duì)地面植物的影響越來(lái)越嚴(yán)重，主要原因之一是其產(chǎn)生的活性氧[2]．活性氧是指在生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和易形成自由基的過(guò)氧化物的總稱[3]．它能引起植物核酸破壞、酶的抑制、蛋白質(zhì)氧化以及膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等[4]．氧化產(chǎn)物 MDA，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性．此外，紫外產(chǎn)生過(guò)剩的光能也會(huì)在光合系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ中將電子傳給氧氣使之變成 O2-，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，引起MDA的積累[5]．UV輻射影響捕光系統(tǒng)，抑制光合成中電子的運(yùn)輸，光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)是 UV破壞的主要部位，會(huì)導(dǎo)致光化學(xué)率Fv/Fm下降[6]．
植物在遇到脅迫后，會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)增加抗氧化酶活性或非酶抗氧化物質(zhì)的合成來(lái)清除活性氧．前者為SOD、POD、CAT、APX、GPX等構(gòu)成酶促系統(tǒng)，后者為類胡蘿卜素、抗壞血酸、谷胱甘肽、類黃酮、生育酚等構(gòu)成的非酶促系統(tǒng)[7]．其中，類胡蘿卜素是具有抗氧化性的一類色素，跟植物的光損傷保護(hù)、光能的捕獲以及膜穩(wěn)定性相關(guān)，尤其是植物在逆境下的發(fā)育及生理活動(dòng)中．編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因 chyB是抗逆研究非常關(guān)鍵的一個(gè)基因．Cho等[8]研究轉(zhuǎn)chyB基因的擬南芥發(fā)現(xiàn)，其中玉米黃質(zhì)、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)提高．番茄中克隆的 chyB基因轉(zhuǎn)入煙草后，相關(guān)類胡蘿卜素含量提高，使得自由基清除能力增強(qiáng)，抗氧化性急劇提高[9]．Davison等[10]使chyB基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)，增大了葉黃素循環(huán)池，降低了脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，提高了擬南芥對(duì)高光照和高溫的抗性．
此外，類胡蘿卜素包括葉黃素和其他玉米黃質(zhì)生成的葉黃素類等，是光捕獲天線復(fù)合物的重要成分，不僅能保護(hù)光合成機(jī)構(gòu)，防止光氧化[11-12]，還能觸發(fā)非光化學(xué)猝滅，消耗過(guò)多的熱能，同時(shí)對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)也起到保護(hù)作用[13-14]．據(jù)研究，葉黃素循環(huán)耗散過(guò)量激發(fā)能，與非光化學(xué)猝面系數(shù)(NPQ)存在密切的正相關(guān)關(guān)系[15]．葉黃素參與光系統(tǒng)中捕光色素蛋白復(fù)合物的組裝、結(jié)構(gòu)，并保持其功能的穩(wěn)定性[16]．
本實(shí)驗(yàn)中研究對(duì)象為洋桔梗．洋桔梗名草原龍膽，屬龍膽科，其花期較長(zhǎng)、花色多樣、花型艷麗，是著名的觀賞植物，越來(lái)越受到人們喜愛(ài)[17]．基因工程能夠?qū)愒椿蛞?，?duì)洋桔梗進(jìn)行改良，包括其顏色、香味、紫外下顯熒光、花期花型和抗除草劑等方面[18-22]．Zhao等[23]將擬南芥中的 FT基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入洋桔梗中，并成功表達(dá)．Wu等[24]成功將 AtchyB基因轉(zhuǎn)入洋桔梗，其強(qiáng)光脅迫下相關(guān)類胡蘿卜素含量顯著提高．
筆者從紫外脅迫方面對(duì)轉(zhuǎn)AtchyB基因洋桔梗的抗氧化性進(jìn)行了進(jìn)一步研究．通過(guò)轉(zhuǎn)基因洋桔梗 3種重要酶促系統(tǒng)SOD、POD、CAT和非酶促類胡蘿卜素含量的測(cè)定，分析其清除機(jī)制．光合參數(shù)的測(cè)定，反映植物光合效率及對(duì)過(guò)剩光能的淬滅能力，以此研究chyB基因表達(dá)的影響．
1 材料和方法
1.1 植物材料
轉(zhuǎn)基因洋桔梗來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室．2個(gè)品系為轉(zhuǎn)AtchyB基因(來(lái)自擬南芥，NM_001036638.2)洋桔梗T1代，標(biāo)記為L(zhǎng)5、L8、L10、L25．野生型對(duì)照WT．
所用質(zhì)粒載體為本實(shí)驗(yàn)室保存的植物雙元表達(dá)載體 pCambia2300，含有卡那霉素抗性基因，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖 1．所用根癌農(nóng)桿菌株為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有pCambia2300-AtchyB的C58菌株，農(nóng)桿菌C58具有卡那霉素抗性．
1.2 植株陽(yáng)性驗(yàn)證
1.2.1 PCR驗(yàn)證
取野生及轉(zhuǎn)基因植株葉片 CTAB法提取基因組后，進(jìn)行PCR檢測(cè)，見(jiàn)表1．
表1 PCR檢測(cè)分析的引物Tab.1 Primers used for PCR analysis
1.2.2 Northern blot分析
Northern blot檢測(cè)使用羅氏試劑盒(DIG Northern Starter Kit)，以 DNA為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程合成大量 RNA轉(zhuǎn)錄本，用地高辛標(biāo)記得到探針，進(jìn)行雜交分子的檢測(cè)．
1.3 UV-B照射
取長(zhǎng)勢(shì)良好的洋桔梗第2對(duì)葉片，其中1個(gè)為對(duì)照，摘下后低光保存，另 1個(gè)放在美國(guó)伯樂(lè)GelDocXR凝膠成像儀下(UV-B透射光302,nm)照射15 min為1次，中間間隔5 min，共進(jìn)行3次．
1.4 HPLC測(cè)定類胡蘿卜素
方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[24]．HPLC測(cè)得了 WT及 L8、L25在脅迫前、脅迫后的相關(guān)類胡蘿卜素值．包括新黃質(zhì)(neoxanthin，N)、紫黃質(zhì)(violaxanthin，V)、花藥黃質(zhì)(antheraxanthin，A)、玉米黃質(zhì)(zeaxanthin，Z)、代表黃素循環(huán)池的 V-A-Z 三者之和、葉黃素(lutein，L)、β-胡蘿卜素(β-carotene，B)和總類胡蘿卜素(T)的含量．
1.5 SOD、POD、CAT及MDA的測(cè)定
可溶蛋白測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)比色法．蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：BSA制成梯度溶液，與考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)后用UV-分光光度計(jì)測(cè)595,nm下的OD值．
SOD、POD、CAT和 MDA的測(cè)定：取葉片0.1,g，加入 0.1,mol/L的磷酸緩沖液，用組織研磨器研磨成漿．3,000,r/min離心 10,min，取上層勻漿液.用南京建成生物工程研究所的試劑盒方法測(cè)定相關(guān)參數(shù)，并計(jì)算酶活及MDA含量，3次重復(fù)取平均．
1.6 LI-6400便攜式光合儀測(cè)定光合參數(shù)
為了保證離體測(cè)量盡量接近植物正常條件下的參數(shù)，在早上摘取葉片后立即用濕的脫脂棉包裹葉柄處防止空氣進(jìn)入葉柄．后經(jīng)紫外照射后黑暗處進(jìn)行20 min暗適應(yīng)，用光合儀葉室?jiàn)A住葉片，測(cè)定初始熒光(Fo)、可變熒光(Fv)、最大熒光(Fm)和恒態(tài)熒光(Fs)．保證測(cè)定時(shí)間在9：00—11：00之間．儀器作用光打開(kāi)，0.5,h預(yù)熱．葉片放置光下 0.5,h進(jìn)行光適應(yīng)后，測(cè)定作用光下的最小熒光(Fo′)、最大熒光(Fm′).通過(guò)計(jì)算得到Fv/Fm、ΦPSⅡ、NPQ和qP．
Fv/Fm是常用于度量植物PSⅡ活性的重要指標(biāo)，反映植物葉片原初光能轉(zhuǎn)換效率．ΦPSⅡ表示實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映 PSⅡ反應(yīng)中心在部分關(guān)閉時(shí)的實(shí)際原初光能捕獲效率．PSⅡ天線色素吸收光能用于電子鏈傳遞，而剩余的被耗散的部分由 NPQ反映．qP表示 PSⅡ天線色素吸收光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額，反映質(zhì)體醌氧化狀態(tài)和 PSⅡ電子傳遞活性．
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)
以下脅迫前后變化值皆為脅迫后值減去脅迫前值．用spss17.0軟件對(duì)L8和L25分別與WT進(jìn)行獨(dú)立 T-test．?dāng)?shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示．顯著性分析：P＜0.05時(shí)，用 a標(biāo)記，代表顯著；P＜0.01時(shí)，用b標(biāo)記，代表極顯著．
2 結(jié) 果
2.1 陽(yáng)性驗(yàn)證
PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖 2所示，northern blot驗(yàn)證結(jié)果如圖 3所示．根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，最終選擇L8和L25作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象．
圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis analysis of PCR products
圖3 Northern blot 驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Northern blot verification result
2.2 類胡蘿卜素含量
紫外前后相關(guān)類胡蘿卜素含量如圖4所示．
紫外照射之前，轉(zhuǎn)基因植株的類胡蘿卜素含量顯著高于野生植株．其中，L8與野生比較，V-A-Z、N、T顯著高于WT．L25與野生植株比較，V-A-Z、N、L、T顯著高于 WT．β-胡蘿卜素含量在轉(zhuǎn)基因系與對(duì)照間無(wú)顯著差異．
紫外照射后，L8和 L25的 V-A-Z、N、L、T顯著高于WT；β-胡蘿卜素顯著低于對(duì)照．
紫外后與紫外前的差值(見(jiàn)表 2)比較可以看出，對(duì)照的類胡蘿卜素含量都有所降低．而轉(zhuǎn)基因植株的 V-A-Z、N、L變化不明顯．差別最明顯的是 V-AZ，在WT中其含量下降了26.59%；而脅迫后轉(zhuǎn)基因植株中其含量有所提高，L8與 L25分別提高了2.08%和 11.05%．轉(zhuǎn)基因植株β-胡蘿卜素下降值高于對(duì)照．WT、L8和L25 3者的β-胡蘿卜素下降分別為 29.74%、81.05%、74.08%，總類胡蘿卜素含量下降分別為21.36%、10.10%、3.85%．
圖4 紫外照射前后WT、L8和L25類胡蘿卜素含量Fig.4 Content of carotenoids in WT，L8，L25 before and after UV irradiation
表2 紫外照射前后WT、L8和L25類胡蘿卜素含量變化值Tab.2 Chang values of the carotenoids in WT，L8，L25 before and after UV irradiation μg/g
2.3 SOD、POD、CAT及MDA
標(biāo)準(zhǔn)曲線公式 y=0.920,64,x，相關(guān)系數(shù) R2= 0.991,89＞0.98，斜率值有意義．
測(cè)得的SOD、POD、CAT 3種酶值及MDA在紫外前后值如圖 5所示．可見(jiàn)，紫外脅迫前，L8和 L25的SOD都顯著低于野生植株，POD極顯著高于野生植株，而CAT顯著高于野生植株．
紫外脅迫后，3種酶值都有所降低，轉(zhuǎn)基因植株的SOD與野生植株存在極顯著差異，POD仍極顯著高于野生植株．轉(zhuǎn)基因植株與野生植株 CAT趨于相同．
圖5 紫外照射前后酶值及MDA值Fig.5 Enzyme activity and MDA content before and after UV irradiation
脅迫前后變化值(見(jiàn)表 3)的比較顯示，轉(zhuǎn)基因植株的 SOD降低值顯著大于野生植株．L8和 L25的變化值是對(duì)照的2.61和2.62倍，POD和CAT變化值在轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照間無(wú)顯著差異．脅迫前后，轉(zhuǎn)基因植株和野生植株的MDA值存在著差異，但是由于誤差原因，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析后并不能確定這一差異的顯著性．
表3 紫外照射前后酶及MDA的變化值Tab.3 Change values of the enzyme activity and MDA content before and after UV irradiation
2.4 光合參數(shù)
測(cè)量的光合參數(shù)值包括 Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP及 NPQ值，如表4所示．
數(shù)據(jù)分析得出，紫外前轉(zhuǎn)基因植株與野生植株比較，光化學(xué)效率 Fv/Fm、ΦPSⅡ、NPQ和 qP值都無(wú)顯著 差異．
紫外照射后(見(jiàn)圖 6)，3個(gè)植株的各項(xiàng)參數(shù)都受到一定影響．轉(zhuǎn)基因植株 Fv/Fm、ΦPSⅡ顯著高于野生植株；qP差異不顯著．轉(zhuǎn)基因植株的 NPQ值略高于對(duì)照，其中L25的值高于對(duì)照85.71%．
圖6 紫外照射后光合參數(shù)Fig.6 Photosynthetic parameters after UV irradiation
3 結(jié) 論
(1) 紫外照射前，AtchyB基因在洋桔梗中的表達(dá)不同程度上提高了β-胡蘿卜素下游相關(guān)色素含量，但是β-胡蘿卜素含量無(wú)顯著差異．紫外的作用使得β-胡蘿卜素含量下降，尤其是轉(zhuǎn)基因植株，比野生植株下降更嚴(yán)重．這也說(shuō)明了UV-B輻射下AtchyB基因表達(dá)加強(qiáng)，V-A-Z(紫黃質(zhì)-花藥黃質(zhì)-玉米黃質(zhì))、N(新黃質(zhì))、L(葉黃素)不同程度的提高體現(xiàn)了其在植物逆境時(shí)去除活性氧方面發(fā)揮了必要的作用．轉(zhuǎn)基因植株的總類胡蘿卜素含量下降低于對(duì)照，尤其是L25，說(shuō)明了轉(zhuǎn)基因植株在逆境中更加穩(wěn)定．
(2) 紫外照射前，轉(zhuǎn)基因植株的SOD低于對(duì)照，而POD、CAT的值高于對(duì)照，這表明類胡蘿卜素這種非酶促系統(tǒng)對(duì)酶促系統(tǒng)產(chǎn)生了影響．紫外照射后，SOD的顯著變化顯示，其在轉(zhuǎn)基因植株中對(duì)紫外脅迫敏感度強(qiáng)于對(duì)照，可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因植株的酶促系統(tǒng)防御機(jī)制在逆境下較弱．但是MDA這種氧化產(chǎn)物并未有明顯變化．這可能是植物的酶促系統(tǒng)與非酶促系統(tǒng)起到了協(xié)同作用的結(jié)果，二者共同起到了抗氧化作用．
(3) 紫外照射前，光合的4個(gè)重要生理指標(biāo)在轉(zhuǎn)基因植株和野生植株間無(wú)顯著差異．紫外脅迫后，F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ、NPQ在對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株間出現(xiàn)差異，體現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因植株高的抗逆性．qP值說(shuō)明基因的表達(dá)對(duì)光化學(xué)淬滅影響不大．轉(zhuǎn)基因植株 NPQ的增加高于對(duì)照，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株有更高的熱耗散能力即非光化學(xué)淬滅能力，在逆境下自我調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)．
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（責(zé)任編輯：田 軍）
Effect of Over-Expression of AtchyB on the Oxidation Resistance of Transgenic Eustoma Grandiflorum
Ji Jing1,2，Yang Hailan1,2，Wang Gang1,2，Wu Weidang1，Jin Chao2，Wu Jiang1,2
(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Research Institute of Genetic Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China)
T1 generation of the transgenic Eustoma grandiflorum was obtained by over-expressing AtchyB gene encoding β-carotene hydroxylase，and they were detected by PCR and northern blot technology. UV-B radiation stress was applied to the transgenic lines(L8 and L25)and the control，then the carotenoids content，oxydase activities(SOD、POD、CAT)，MDA and the photosynthetic parameters before and after the radiation were analyzed. The results are as follows：① UV-B strengthened the gene expression level，and the carotenoids related to the oxidation resistance in the transgenic lines are much higher compared to the control. Besides，the xanthophyll cycle is strongly enhanced in transgenic lines．② the enzymatic system has an effect on the non-enzymatic system，so there has some difference in the oxydase activities between the transgenic lines and the control. The SOD of the transgenic lines is more sensitive to the UV-B radiation stress，but there is no significant difference in MDA content probably due to the synergy of the two systems. ③ The Fv/Fmand ΦPSⅡvalue of transgenic lines are significantly higher，which shows the stronger oxidation resistance to UV-B radiation stress. The undifferentiated qPvalue shows that over-expression of AtchyB gene has no effect on the photochemical quenching. The higher value of NPQ in L25 means its nonphotochemical quenching ability has bean improved.
transgenic Eustoma grandiflorum；AtchyB gene；carotenoids；oxidation resistance；photosynthesis
Q945
A
0493-2137(2014)08-0735-06
10.11784/tdxbz201212037
2012-12-17；
2013-03-06.
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271793，31271419)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2014ZX08003-002B).
季 靜（1965— ），女，博士，教授，jijingtjdx@163.com.
楊海蘭，yanghailan@tju.edu.cn.
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季 靜，楊海蘭，王 罡，武衛(wèi)黨，金 超，吳 疆
(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 天津大學(xué)遺傳工程研究所，天津 300072)
AtchyB基因過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因洋桔?？寡趸缘挠绊?/p>
季 靜1,2，楊海蘭1,2，王 罡1,2，武衛(wèi)黨1，金 超2，吳 疆1,2
(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 天津大學(xué)遺傳工程研究所，天津 300072)
由轉(zhuǎn)β-胡蘿卜羥化酶(AtchyB)基因的洋桔梗獲得T1代轉(zhuǎn)基因系，經(jīng)PCR及northern blot技術(shù)檢測(cè)后，對(duì)L8和 L25兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系及野生對(duì)照進(jìn)行 UV-B紫外脅迫處理．檢測(cè)脅迫前后植株的類胡蘿卜素、氧化酶(SOD、POD、CAT)和 MDA及光合作用相關(guān)參數(shù)值．對(duì)比結(jié)果表明：① 脅迫使得基因表達(dá)水平強(qiáng)化，轉(zhuǎn)基因系中與抗氧化性相關(guān)類胡蘿卜素顯著高于對(duì)照，葉黃素循環(huán)池顯著放大；② 酶促系統(tǒng)對(duì)非酶促系統(tǒng)產(chǎn)生影響，使得轉(zhuǎn)基因系與對(duì)照間的酶活力存在差異，和對(duì)照比，轉(zhuǎn)基因系的SOD對(duì)紫外脅迫更敏感，但MDA無(wú)顯著差異，這可能是兩種系統(tǒng)協(xié)調(diào)作用的結(jié)果；③ 脅迫后，轉(zhuǎn)基因系 Fv/Fm和 ΦPSⅡ值顯著高于對(duì)照，體現(xiàn)出其更強(qiáng)的抗氧化性．qP值顯示AtchyB基因過(guò)表達(dá)對(duì)洋桔梗光化學(xué)猝滅影響不大，其中L25的NPQ顯著高于對(duì)照，可見(jiàn)其非光化學(xué)淬滅能力有所提高．
轉(zhuǎn)基因洋桔梗；AtchyB基因；類胡蘿卜素；抗氧化性；光合作用
非生物脅迫包括溫度、干旱、鹽分、重金屬及輻射等，嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[1]．隨著臭氧層的破壞，紫外-B(UV-B，280～315,nm)的輻射對(duì)地面植物的影響越來(lái)越嚴(yán)重，主要原因之一是其產(chǎn)生的活性氧[2]．活性氧是指在生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和易形成自由基的過(guò)氧化物的總稱[3]．它能引起植物核酸破壞、酶的抑制、蛋白質(zhì)氧化以及膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等[4]．氧化產(chǎn)物 MDA，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性．此外，紫外產(chǎn)生過(guò)剩的光能也會(huì)在光合系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ中將電子傳給氧氣使之變成 O2-，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，引起MDA的積累[5]．UV輻射影響捕光系統(tǒng)，抑制光合成中電子的運(yùn)輸，光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)是 UV破壞的主要部位，會(huì)導(dǎo)致光化學(xué)率Fv/Fm下降[6]．
植物在遇到脅迫后，會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)增加抗氧化酶活性或非酶抗氧化物質(zhì)的合成來(lái)清除活性氧．前者為SOD、POD、CAT、APX、GPX等構(gòu)成酶促系統(tǒng)，后者為類胡蘿卜素、抗壞血酸、谷胱甘肽、類黃酮、生育酚等構(gòu)成的非酶促系統(tǒng)[7]．其中，類胡蘿卜素是具有抗氧化性的一類色素，跟植物的光損傷保護(hù)、光能的捕獲以及膜穩(wěn)定性相關(guān)，尤其是植物在逆境下的發(fā)育及生理活動(dòng)中．編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因 chyB是抗逆研究非常關(guān)鍵的一個(gè)基因．Cho等[8]研究轉(zhuǎn)chyB基因的擬南芥發(fā)現(xiàn)，其中玉米黃質(zhì)、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)提高．番茄中克隆的 chyB基因轉(zhuǎn)入煙草后，相關(guān)類胡蘿卜素含量提高，使得自由基清除能力增強(qiáng)，抗氧化性急劇提高[9]．Davison等[10]使chyB基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)，增大了葉黃素循環(huán)池，降低了脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，提高了擬南芥對(duì)高光照和高溫的抗性．
此外，類胡蘿卜素包括葉黃素和其他玉米黃質(zhì)生成的葉黃素類等，是光捕獲天線復(fù)合物的重要成分，不僅能保護(hù)光合成機(jī)構(gòu)，防止光氧化[11-12]，還能觸發(fā)非光化學(xué)猝滅，消耗過(guò)多的熱能，同時(shí)對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)也起到保護(hù)作用[13-14]．據(jù)研究，葉黃素循環(huán)耗散過(guò)量激發(fā)能，與非光化學(xué)猝面系數(shù)(NPQ)存在密切的正相關(guān)關(guān)系[15]．葉黃素參與光系統(tǒng)中捕光色素蛋白復(fù)合物的組裝、結(jié)構(gòu)，并保持其功能的穩(wěn)定性[16]．
本實(shí)驗(yàn)中研究對(duì)象為洋桔梗．洋桔梗名草原龍膽，屬龍膽科，其花期較長(zhǎng)、花色多樣、花型艷麗，是著名的觀賞植物，越來(lái)越受到人們喜愛(ài)[17]．基因工程能夠?qū)愒椿蛞?，?duì)洋桔梗進(jìn)行改良，包括其顏色、香味、紫外下顯熒光、花期花型和抗除草劑等方面[18-22]．Zhao等[23]將擬南芥中的 FT基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入洋桔梗中，并成功表達(dá)．Wu等[24]成功將 AtchyB基因轉(zhuǎn)入洋桔梗，其強(qiáng)光脅迫下相關(guān)類胡蘿卜素含量顯著提高．
筆者從紫外脅迫方面對(duì)轉(zhuǎn)AtchyB基因洋桔梗的抗氧化性進(jìn)行了進(jìn)一步研究．通過(guò)轉(zhuǎn)基因洋桔梗 3種重要酶促系統(tǒng)SOD、POD、CAT和非酶促類胡蘿卜素含量的測(cè)定，分析其清除機(jī)制．光合參數(shù)的測(cè)定，反映植物光合效率及對(duì)過(guò)剩光能的淬滅能力，以此研究chyB基因表達(dá)的影響．
1 材料和方法
1.1 植物材料
轉(zhuǎn)基因洋桔梗來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室．2個(gè)品系為轉(zhuǎn)AtchyB基因(來(lái)自擬南芥，NM_001036638.2)洋桔梗T1代，標(biāo)記為L(zhǎng)5、L8、L10、L25．野生型對(duì)照WT．
所用質(zhì)粒載體為本實(shí)驗(yàn)室保存的植物雙元表達(dá)載體 pCambia2300，含有卡那霉素抗性基因，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖 1．所用根癌農(nóng)桿菌株為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有pCambia2300-AtchyB的C58菌株，農(nóng)桿菌C58具有卡那霉素抗性．
1.2 植株陽(yáng)性驗(yàn)證
1.2.1 PCR驗(yàn)證
取野生及轉(zhuǎn)基因植株葉片 CTAB法提取基因組后，進(jìn)行PCR檢測(cè)，見(jiàn)表1．
表1 PCR檢測(cè)分析的引物Tab.1 Primers used for PCR analysis
1.2.2 Northern blot分析
Northern blot檢測(cè)使用羅氏試劑盒(DIG Northern Starter Kit)，以 DNA為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程合成大量 RNA轉(zhuǎn)錄本，用地高辛標(biāo)記得到探針，進(jìn)行雜交分子的檢測(cè)．
1.3 UV-B照射
取長(zhǎng)勢(shì)良好的洋桔梗第2對(duì)葉片，其中1個(gè)為對(duì)照，摘下后低光保存，另 1個(gè)放在美國(guó)伯樂(lè)GelDocXR凝膠成像儀下(UV-B透射光302,nm)照射15 min為1次，中間間隔5 min，共進(jìn)行3次．
1.4 HPLC測(cè)定類胡蘿卜素
方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[24]．HPLC測(cè)得了 WT及 L8、L25在脅迫前、脅迫后的相關(guān)類胡蘿卜素值．包括新黃質(zhì)(neoxanthin，N)、紫黃質(zhì)(violaxanthin，V)、花藥黃質(zhì)(antheraxanthin，A)、玉米黃質(zhì)(zeaxanthin，Z)、代表黃素循環(huán)池的 V-A-Z 三者之和、葉黃素(lutein，L)、β-胡蘿卜素(β-carotene，B)和總類胡蘿卜素(T)的含量．
1.5 SOD、POD、CAT及MDA的測(cè)定
可溶蛋白測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)比色法．蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：BSA制成梯度溶液，與考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)后用UV-分光光度計(jì)測(cè)595,nm下的OD值．
SOD、POD、CAT和 MDA的測(cè)定：取葉片0.1,g，加入 0.1,mol/L的磷酸緩沖液，用組織研磨器研磨成漿．3,000,r/min離心 10,min，取上層勻漿液.用南京建成生物工程研究所的試劑盒方法測(cè)定相關(guān)參數(shù)，并計(jì)算酶活及MDA含量，3次重復(fù)取平均．
1.6 LI-6400便攜式光合儀測(cè)定光合參數(shù)
為了保證離體測(cè)量盡量接近植物正常條件下的參數(shù)，在早上摘取葉片后立即用濕的脫脂棉包裹葉柄處防止空氣進(jìn)入葉柄．后經(jīng)紫外照射后黑暗處進(jìn)行20 min暗適應(yīng)，用光合儀葉室?jiàn)A住葉片，測(cè)定初始熒光(Fo)、可變熒光(Fv)、最大熒光(Fm)和恒態(tài)熒光(Fs)．保證測(cè)定時(shí)間在9：00—11：00之間．儀器作用光打開(kāi)，0.5,h預(yù)熱．葉片放置光下 0.5,h進(jìn)行光適應(yīng)后，測(cè)定作用光下的最小熒光(Fo′)、最大熒光(Fm′).通過(guò)計(jì)算得到Fv/Fm、ΦPSⅡ、NPQ和qP．
Fv/Fm是常用于度量植物PSⅡ活性的重要指標(biāo)，反映植物葉片原初光能轉(zhuǎn)換效率．ΦPSⅡ表示實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映 PSⅡ反應(yīng)中心在部分關(guān)閉時(shí)的實(shí)際原初光能捕獲效率．PSⅡ天線色素吸收光能用于電子鏈傳遞，而剩余的被耗散的部分由 NPQ反映．qP表示 PSⅡ天線色素吸收光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額，反映質(zhì)體醌氧化狀態(tài)和 PSⅡ電子傳遞活性．
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)
以下脅迫前后變化值皆為脅迫后值減去脅迫前值．用spss17.0軟件對(duì)L8和L25分別與WT進(jìn)行獨(dú)立 T-test．?dāng)?shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示．顯著性分析：P＜0.05時(shí)，用 a標(biāo)記，代表顯著；P＜0.01時(shí)，用b標(biāo)記，代表極顯著．
2 結(jié) 果
2.1 陽(yáng)性驗(yàn)證
PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖 2所示，northern blot驗(yàn)證結(jié)果如圖 3所示．根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，最終選擇L8和L25作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象．
圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis analysis of PCR products
圖3 Northern blot 驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Northern blot verification result
2.2 類胡蘿卜素含量
紫外前后相關(guān)類胡蘿卜素含量如圖4所示．
紫外照射之前，轉(zhuǎn)基因植株的類胡蘿卜素含量顯著高于野生植株．其中，L8與野生比較，V-A-Z、N、T顯著高于WT．L25與野生植株比較，V-A-Z、N、L、T顯著高于 WT．β-胡蘿卜素含量在轉(zhuǎn)基因系與對(duì)照間無(wú)顯著差異．
紫外照射后，L8和 L25的 V-A-Z、N、L、T顯著高于WT；β-胡蘿卜素顯著低于對(duì)照．
紫外后與紫外前的差值(見(jiàn)表 2)比較可以看出，對(duì)照的類胡蘿卜素含量都有所降低．而轉(zhuǎn)基因植株的 V-A-Z、N、L變化不明顯．差別最明顯的是 V-AZ，在WT中其含量下降了26.59%；而脅迫后轉(zhuǎn)基因植株中其含量有所提高，L8與 L25分別提高了2.08%和 11.05%．轉(zhuǎn)基因植株β-胡蘿卜素下降值高于對(duì)照．WT、L8和L25 3者的β-胡蘿卜素下降分別為 29.74%、81.05%、74.08%，總類胡蘿卜素含量下降分別為21.36%、10.10%、3.85%．
圖4 紫外照射前后WT、L8和L25類胡蘿卜素含量Fig.4 Content of carotenoids in WT，L8，L25 before and after UV irradiation
表2 紫外照射前后WT、L8和L25類胡蘿卜素含量變化值Tab.2 Chang values of the carotenoids in WT，L8，L25 before and after UV irradiation μg/g
2.3 SOD、POD、CAT及MDA
標(biāo)準(zhǔn)曲線公式 y=0.920,64,x，相關(guān)系數(shù) R2= 0.991,89＞0.98，斜率值有意義．
測(cè)得的SOD、POD、CAT 3種酶值及MDA在紫外前后值如圖 5所示．可見(jiàn)，紫外脅迫前，L8和 L25的SOD都顯著低于野生植株，POD極顯著高于野生植株，而CAT顯著高于野生植株．
紫外脅迫后，3種酶值都有所降低，轉(zhuǎn)基因植株的SOD與野生植株存在極顯著差異，POD仍極顯著高于野生植株．轉(zhuǎn)基因植株與野生植株 CAT趨于相同．
圖5 紫外照射前后酶值及MDA值Fig.5 Enzyme activity and MDA content before and after UV irradiation
脅迫前后變化值(見(jiàn)表 3)的比較顯示，轉(zhuǎn)基因植株的 SOD降低值顯著大于野生植株．L8和 L25的變化值是對(duì)照的2.61和2.62倍，POD和CAT變化值在轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照間無(wú)顯著差異．脅迫前后，轉(zhuǎn)基因植株和野生植株的MDA值存在著差異，但是由于誤差原因，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析后并不能確定這一差異的顯著性．
表3 紫外照射前后酶及MDA的變化值Tab.3 Change values of the enzyme activity and MDA content before and after UV irradiation
2.4 光合參數(shù)
測(cè)量的光合參數(shù)值包括 Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP及 NPQ值，如表4所示．
數(shù)據(jù)分析得出，紫外前轉(zhuǎn)基因植株與野生植株比較，光化學(xué)效率 Fv/Fm、ΦPSⅡ、NPQ和 qP值都無(wú)顯著 差異．
紫外照射后(見(jiàn)圖 6)，3個(gè)植株的各項(xiàng)參數(shù)都受到一定影響．轉(zhuǎn)基因植株 Fv/Fm、ΦPSⅡ顯著高于野生植株；qP差異不顯著．轉(zhuǎn)基因植株的 NPQ值略高于對(duì)照，其中L25的值高于對(duì)照85.71%．
圖6 紫外照射后光合參數(shù)Fig.6 Photosynthetic parameters after UV irradiation
3 結(jié) 論
(1) 紫外照射前，AtchyB基因在洋桔梗中的表達(dá)不同程度上提高了β-胡蘿卜素下游相關(guān)色素含量，但是β-胡蘿卜素含量無(wú)顯著差異．紫外的作用使得β-胡蘿卜素含量下降，尤其是轉(zhuǎn)基因植株，比野生植株下降更嚴(yán)重．這也說(shuō)明了UV-B輻射下AtchyB基因表達(dá)加強(qiáng)，V-A-Z(紫黃質(zhì)-花藥黃質(zhì)-玉米黃質(zhì))、N(新黃質(zhì))、L(葉黃素)不同程度的提高體現(xiàn)了其在植物逆境時(shí)去除活性氧方面發(fā)揮了必要的作用．轉(zhuǎn)基因植株的總類胡蘿卜素含量下降低于對(duì)照，尤其是L25，說(shuō)明了轉(zhuǎn)基因植株在逆境中更加穩(wěn)定．
(2) 紫外照射前，轉(zhuǎn)基因植株的SOD低于對(duì)照，而POD、CAT的值高于對(duì)照，這表明類胡蘿卜素這種非酶促系統(tǒng)對(duì)酶促系統(tǒng)產(chǎn)生了影響．紫外照射后，SOD的顯著變化顯示，其在轉(zhuǎn)基因植株中對(duì)紫外脅迫敏感度強(qiáng)于對(duì)照，可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因植株的酶促系統(tǒng)防御機(jī)制在逆境下較弱．但是MDA這種氧化產(chǎn)物并未有明顯變化．這可能是植物的酶促系統(tǒng)與非酶促系統(tǒng)起到了協(xié)同作用的結(jié)果，二者共同起到了抗氧化作用．
(3) 紫外照射前，光合的4個(gè)重要生理指標(biāo)在轉(zhuǎn)基因植株和野生植株間無(wú)顯著差異．紫外脅迫后，F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ、NPQ在對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株間出現(xiàn)差異，體現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因植株高的抗逆性．qP值說(shuō)明基因的表達(dá)對(duì)光化學(xué)淬滅影響不大．轉(zhuǎn)基因植株 NPQ的增加高于對(duì)照，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株有更高的熱耗散能力即非光化學(xué)淬滅能力，在逆境下自我調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)．
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（責(zé)任編輯：田 軍）
Effect of Over-Expression of AtchyB on the Oxidation Resistance of Transgenic Eustoma Grandiflorum
Ji Jing1,2，Yang Hailan1,2，Wang Gang1,2，Wu Weidang1，Jin Chao2，Wu Jiang1,2
(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Research Institute of Genetic Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China)
T1 generation of the transgenic Eustoma grandiflorum was obtained by over-expressing AtchyB gene encoding β-carotene hydroxylase，and they were detected by PCR and northern blot technology. UV-B radiation stress was applied to the transgenic lines(L8 and L25)and the control，then the carotenoids content，oxydase activities(SOD、POD、CAT)，MDA and the photosynthetic parameters before and after the radiation were analyzed. The results are as follows：① UV-B strengthened the gene expression level，and the carotenoids related to the oxidation resistance in the transgenic lines are much higher compared to the control. Besides，the xanthophyll cycle is strongly enhanced in transgenic lines．② the enzymatic system has an effect on the non-enzymatic system，so there has some difference in the oxydase activities between the transgenic lines and the control. The SOD of the transgenic lines is more sensitive to the UV-B radiation stress，but there is no significant difference in MDA content probably due to the synergy of the two systems. ③ The Fv/Fmand ΦPSⅡvalue of transgenic lines are significantly higher，which shows the stronger oxidation resistance to UV-B radiation stress. The undifferentiated qPvalue shows that over-expression of AtchyB gene has no effect on the photochemical quenching. The higher value of NPQ in L25 means its nonphotochemical quenching ability has bean improved.
transgenic Eustoma grandiflorum；AtchyB gene；carotenoids；oxidation resistance；photosynthesis
Q945
A
0493-2137(2014)08-0735-06
10.11784/tdxbz201212037
2012-12-17；
2013-03-06.
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271793，31271419)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2014ZX08003-002B).
季 靜（1965— ），女，博士，教授，jijingtjdx@163.com.
楊海蘭，yanghailan@tju.edu.cn.
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