張鑫等

[摘要] 目的 通過研究軟脂酸（PA）對腎小管上皮細(xì)胞Toll樣受體4（TLR4）表達(dá)的影響，初步探討游離脂肪酸（FFA）在引發(fā)腎臟微炎癥反應(yīng)的相關(guān)作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E），采用不同濃度軟脂酸進(jìn)行干預(yù)，用RT- PCR法檢測12 h、24 h后腎小管上皮細(xì)胞TLR4 mRNA水平，ELISA方法檢測24 h后IL-6、TNF-α的表達(dá)。結(jié)果 軟脂酸組的TLR4、IL-6、TNF-α表達(dá)較對照組均明顯升高，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴趨勢（P<0.05）。結(jié)論 軟脂酸可能是通過刺激腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)TLR4而促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 軟脂酸；腎小管上皮細(xì)胞；Toll樣受體-4

[中圖分類號] R692.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）09-0025-03

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的一種常見的、后果嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，由于其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。近年研究表明：高血糖、炎癥、脂毒性、腎小球血流動力學(xué)改變、蛋白質(zhì)的非酶糖基化、凝血機(jī)制異常等多種因素都參與了DN的發(fā)生發(fā)展，其中炎癥因素在DN 的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用， 許多炎癥因子甚至在DN中發(fā)揮致病作用[1]。Toll樣受體4（Toll like receptor-4，TLR4）是引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白，能夠誘導(dǎo)NF-κB激活，啟動IL-1、IL-6、TNF-α和輔助刺激因子CD80、CD86等基因的轉(zhuǎn)錄，引起腎小管上皮發(fā)生微炎癥反應(yīng)。同時(shí)，有關(guān)研究表明，脂代謝異常在DN發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。相關(guān)文獻(xiàn)指出：脂代謝異常是2型糖尿病及其并發(fā)癥的基本病理生理改變[2]，可產(chǎn)生大量游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA），而高濃度的FFA聚集在腎間質(zhì)可導(dǎo)致嚴(yán)重的腎小管及其周圍間質(zhì)損傷[3]。但是關(guān)于FFA是通過什么途徑導(dǎo)致腎小管及其周圍腎間質(zhì)損傷，是否是通過刺激或激活炎癥通路的相關(guān)受體達(dá)到促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)，加速腎臟損害，目前國內(nèi)外鮮有相關(guān)報(bào)道。

本文通過研究高軟脂酸（palmitic acid，PA）（人體內(nèi)含量最高的FFA之一）環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞TLR4 的表達(dá)情況及其信號通路下游炎癥因子的分泌情況，初步探討游離脂肪酸與糖尿病腎病早期腎小管及周圍間質(zhì)微炎癥之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑

正常SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）（博士德，武漢），軟脂酸（Gibco，USA），去脂牛血清白蛋白（d-BSA）（sigma，USA），DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶（博士德，武漢），TRIZOL試劑、一步法cDNA合成試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒（Takar，日本），IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（博士德，武漢）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM 為NRK-52E細(xì)胞的培養(yǎng)液，在含5%CO2濃度37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每2～3天換液并傳代接種，傳代前PBS液漂洗，0.25%胰酶消化。細(xì)胞傳至第四代處于生長對數(shù)期時(shí)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)共設(shè)立五組：（1）對照組設(shè)兩組：①正常培養(yǎng)液組（不施加任何干預(yù)措施），②0.5%d-BSA+ 正常培養(yǎng)液組。（2）根據(jù)軟脂酸干預(yù)濃度不同，將實(shí)驗(yàn)組分為三組： PA125 μmol/L組、PA250 μmol/L組、PA500 μmol/L組，以去脂牛血清白蛋白（d-BSA）為溶解軟脂酸的載體，（各組載體d-BSA含量為0.125%、0.25%、0.5%）。

1.4方法

1.4.1 RT-PCR 法檢測TLR4mRNA 的表達(dá) 用按1mLTrizol/107細(xì)胞提取總RNA，利用紫外分光光度法對其定量，0.7%瓊脂糖凝膠檢查RNA完整性。按照cDNA合成試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。每組各取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃ 30 s 1次； PCR反應(yīng)95℃ 3 s，60℃ 30 s 40次。cDNA 擴(kuò)增所使用的引物包括：TLR4正意鏈引物5-CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTA-3， 反意鏈引物5-GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3， 擴(kuò)增產(chǎn)物長 177bp；β-actin 正意鏈引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'， 反意鏈引物5-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG -3， 擴(kuò)增產(chǎn)物長150 bp。引物委托日本Takar有限公司合成。采用 ABI7300 型擴(kuò)增儀圖像處理系統(tǒng)分析熒光信號并將其轉(zhuǎn)換成Ct 值，計(jì)算公式： 相對mRNA 表達(dá)=2-ΔΔCt，其中ΔCt 值=靶基因Ct 值-Actin Ct 值。ΔΔCt 值=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對照組ΔCt。

1.4.2 ELISA法檢測IL-6、TNF-α的表達(dá) 細(xì)胞干預(yù)達(dá)終點(diǎn)后收集上清液，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書，以酶標(biāo)儀在450 nm測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及OD值計(jì)算各樣本的相應(yīng)濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)間先進(jìn)行單因素方差分析，之后兩兩之間采用LSD最小顯著差異法比較；兩樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測NRK-52E細(xì)胞TRL4表達(dá)結(jié)果

不同濃度的軟脂酸處理腎小管上皮細(xì)胞12 h、24 h后，與對照組相比mRNA表達(dá)上調(diào)，并隨濃度增高而增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；相同濃度組不同時(shí)間段比較，24 h較12 h表達(dá)有所增高，且中、高濃度組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P <0.05），見表1。提示在0 μmol/L～500 μmol/L濃度的軟脂酸之間，其刺激TLR4的表達(dá)在12 h及24 h有一定濃度依賴趨勢，見圖1。

2.2 ELISA檢測NRK-52E細(xì)胞IL-6、TNF-α分泌情況

IL-6：低濃度組與空白對照組、dBSA對照組比較，IL-6的分泌無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；而中、高濃度組與空白組、dBSA對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），并呈現(xiàn)一定的濃度依賴增長趨勢。TNF-α：各組實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，TNF-α分泌量均明顯增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；其中低、高濃度組相比及中、高濃度組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），并且分泌量隨著PA濃度的增高而增加。見表2。

3 討論

近年來，糖尿病發(fā)病率伴隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人們生活方式改變及人口老齡化日趨升高，其諸多并發(fā)癥亦較前明顯增多，其中糖尿病腎病為其重要并發(fā)癥之一。越來越多的研究表明，促炎癥因子和FFA在DN的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用[4]。一方面，1991年Hasegawa等[5]首次證明了炎癥因子（IL-1、TNF-α）在糖尿病腎病的發(fā)展中起重要作用。近年來，Dalla等[6]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者體內(nèi)的IL-6、C反應(yīng)蛋白（CRP）、纖維蛋白原等炎癥因子與促進(jìn)腎臟結(jié)構(gòu)破壞、基底膜增厚有關(guān)。而Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）作為介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的主體，被認(rèn)為是將細(xì)胞外抗原識別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白，近些年研究發(fā)現(xiàn)，其主要通過NF-κB途徑，激活并啟動IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。同時(shí)，在關(guān)于DN的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞有TLR4的高表達(dá)[7]，此外，有研究還發(fā)現(xiàn)TLRS在腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[8-10]。劉抗寒等[11]進(jìn)行了高糖與腎小管上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)關(guān)系的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖可刺激TLR4和IL-6、TNF-α等因子的表達(dá)，提示TLR4參與了DN的微炎癥反應(yīng)。另一方面，通過查閱大量文獻(xiàn)報(bào)道還發(fā)現(xiàn)2型DN患者大多存在脂代謝異常，且隨著病情加重脂代謝亦明顯異常，由此產(chǎn)生大量的FFA，而FFA以白蛋白為載體形成白蛋白-脂肪酸復(fù)合物，其與高糖形成對腎小球的長期刺激，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜通透性增高，進(jìn)而濾過大量的白蛋白-脂肪酸復(fù)合物，這些復(fù)合物中的FFA被近曲小管重吸收后，便會對腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞作用。早在2002年，Kamijo A等[12]就首先報(bào)道了結(jié)合FFA的白蛋白可加重腎小管間質(zhì)的損傷。黃志文、梁東等[13，14]的一系列相關(guān)研究也表明，F(xiàn)FA通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)其細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積并且抑制其降解引起腎小管損害。近幾年來，李媛、韓樂等[15，16]致力于研究FFA通過刺激死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡及刺激iNOS的表達(dá)來促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，而關(guān)于FFA是否通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)，進(jìn)而激活NF-κB途徑，釋放一系列促炎因子，引起腎小管上皮細(xì)胞的損害這方面的研究，報(bào)道很少。因而，本研究通過使用不同濃度軟脂酸（游離脂肪酸的一種）干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞，檢測TLR4 mRNA表達(dá)水平及IL-6、TNF-α的分泌情況，評價(jià)軟脂酸在導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞受損的另一機(jī)制。結(jié)果顯示，12 h及24 h不同濃度軟脂酸組（125 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L）與空白對照組及dBSA干預(yù)組相比，腎小管上皮細(xì)胞上TLR4表達(dá)均升高（P<0.05），而軟脂酸500 μmol/L組與軟脂酸（250 μmol/L、125 μmol/L）相比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示同一時(shí)間點(diǎn)，軟脂酸濃度越大，促進(jìn)腎小管表達(dá)TLR4越多；對于同一濃度軟脂酸不同時(shí)間點(diǎn)（12 h、24 h）作用SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞后，TLR4表達(dá)24 h比12 h明顯增高（P<0.05），可以推測軟脂酸作用腎小管上皮細(xì)胞時(shí)間越長，促使其表達(dá)TLR4可能越多。同時(shí)測定24 h點(diǎn)血清中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著PA濃度的增高二者表達(dá)也同樣增加（P<0.05），提示FFA可能是通過上調(diào)TLR4的表達(dá)，進(jìn)而刺激IL-6、TNF-α等一系列炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)或加重腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，最終造成不同程度的損害。

綜上，DN高糖及高脂引起腎小球通透性增高，F(xiàn)FA結(jié)合載體后被濾過，作用于腎小管的上皮細(xì)胞，通過某種機(jī)制促進(jìn)TLR4的表達(dá)，進(jìn)而通過NF-κB途徑，促進(jìn)IL-6、TNF-α等一系列炎癥因子的分泌，引起腎小管炎癥反應(yīng)，造成其損害，最終加速了糖尿病腎病的發(fā)展。因此，本實(shí)驗(yàn)可能為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供新的思路，但是尚需進(jìn)一步理論和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。

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（收稿日期：2013-12-31）