鐘小紅吳曉安胡冰

1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 230001；

2.解放軍第174 醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建 廈門(mén) 361003

血管緊張素Ⅱ通過(guò)AT1R/ERK/MAPK信號(hào)通路影響乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力

鐘小紅1,2吳曉安2胡冰1

1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 230001；

2.解放軍第174 醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建 廈門(mén) 361003

背景與目的：研究表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切有關(guān)，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是RAS系統(tǒng)最重要的組成部分。本文旨在探討AngⅡ?qū)θ橄侔┘?xì)胞株MCF-7細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)理。方法：采用CCK8法觀察AngⅡ?qū)CF-7細(xì)胞增殖的影響、氯沙坦(AT1R抑制劑)及PD98059(MAPK抑制劑)對(duì)AngⅡ介導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖變化的影響；利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)不同濃度AngⅡ處理MCF-7細(xì)胞后ERK及p-ERK1/2蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：AngⅡ具有明顯的促M(fèi)CF-7細(xì)胞增殖作用，并呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性，分別在24 h時(shí)和10-7mol/L濃度處理時(shí)促進(jìn)作用最為顯著(P＜0.000 1)；氯沙坦能顯著降低AngⅡ促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用(P=0.022)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，AngⅡ能激活p-ERK蛋白的表達(dá)水平；進(jìn)一步用MAPK抑制劑PD98059處理能夠部分逆轉(zhuǎn)AngⅡ的促細(xì)胞增殖作用。結(jié)論：AngⅡ通過(guò)激活A(yù)T1R/ERK信號(hào)通路增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力，使用AT1R抑制劑或MAPK抑制劑均能抑制AngⅡ的作用。因此，靶向AngⅡ/AT1R/MAPK可能為乳腺癌治療提供新的途徑。

乳腺癌；血管緊張素Ⅱ；AT1R；ERK1/2；細(xì)胞增殖

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害廣大女性的健康和生命。美國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出，在活到85歲的婦女中，將有1/8的人患乳腺癌［1］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(reninangiotensin system，RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)RAS系統(tǒng)功能的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是RAS系統(tǒng)最重要的組成成分，有研究證實(shí)AngⅡ的Ⅰ型受體(AT1R)在乳腺癌細(xì)胞及組織中表達(dá)顯著增高［2-3］，而AngⅡ的生理作用幾乎都是通過(guò)激動(dòng)AT1R產(chǎn)生的。本研究旨在探討AngⅡ?qū)θ橄侔┘?xì)胞MCF-7增殖能力的影響，以及AT1R抑制劑及其下游ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑能否部分逆轉(zhuǎn)AngⅡ?qū)CF-7細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；細(xì)胞用培養(yǎng)基RPMI-1640加10%胎牛血清培養(yǎng)。傳代時(shí)用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。AngⅡ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)A9525，用去離子水溶解，配制母液濃度10-3mol/L，-20 ℃保存。氯沙坦購(gòu)于美國(guó)Selleckchem公司，貨號(hào)S1359，用PBS溶解，配制母液濃度10-2mol/L，-80 ℃保存。PD98059(MEK1 Inhibitor，9900，1.5 mg)、p44/42 MAPK(Erk1/2，9102，1∶1000)及Phospho-MAPK (Erk1/2，4376，1∶1000)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

以2 500個(gè)/孔(100 μL/孔)的濃度將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種到96孔板，每孔設(shè)3個(gè)對(duì)照孔；待細(xì)胞貼壁后，分別予以不同處理后，每孔加入10 μL CCK8，溫育2 h；用自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定各孔的吸光度(A)值，最后取各樣本的平均值進(jìn)行比較。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)

細(xì)胞收集后加入RIPA裂解液(1×PBS，1%NP40，0.1%SDS，5×10-3mol/L EDTA，0.5%去氧膽酸鈉，1×10-3mol/L原釩酸鈉)，常規(guī)方法提取細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；取30 μg蛋白質(zhì)，行10%SDS-PAGE電泳；電泳完畢后，于4 ℃、90 V電轉(zhuǎn)移2 h至PVDF膜上；PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；后加入一抗4 ℃溫育過(guò)夜；洗膜后，加入二抗，室溫溫育1.5 h；洗膜后，加入現(xiàn)配的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)常規(guī)顯像；以β-actin為內(nèi)對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖的影響

為了研究AngⅡ?qū)?xì)胞增殖的影響，本研究首先用濃度為10-7mol/L的AngⅡ處理細(xì)胞，分別在0、12和24 h檢測(cè)A值。結(jié)果顯示，AngⅡ在24 h時(shí)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最顯著(P＜0.000 1，圖1A)，在0和24 h時(shí)的A值分別為0.661 3±0.005 9和0.892 3±0.002 1。隨后用不同濃度(0～10-5mol/L)的AngⅡ處理MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后檢測(cè)A值。結(jié)果表明，AngⅡ?qū)CF-7細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在10-7mol/L最明顯(P＜0.000 1，圖1B)，0和10-7mol/L時(shí)的A值分別為0.485 3±0.005 7和0.724 0±0.022 5。以上結(jié)果提示，AngⅡ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力，并呈現(xiàn)時(shí)間及劑量依賴(lài)性。

2.2 AngⅡ通過(guò)AT1R途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖

AngⅡ的生理功能幾乎都是通過(guò)結(jié)合AT1R來(lái)起作用的。為了研究AT1R在AngⅡ促細(xì)胞增殖中的作用，本研究將MCF-7細(xì)胞分為4組：空白組、AngⅡ組、氯沙坦組和AngⅡ+氯沙坦組。CCK8法結(jié)果顯示，AngⅡ組的細(xì)胞增殖能力較空白組明顯提高(P=0.028)，AngⅡ+氯沙坦組的細(xì)胞增殖能力較AngⅡ組明顯下降(P=0.022，圖2)。而氯沙坦組與空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.981)。這些結(jié)果顯示，AngⅡ通過(guò)AT1R來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力。

2.3 AngⅡ激活ERK/MAPK信號(hào)通路

為了進(jìn)一步研究AngⅡ促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖能力的機(jī)制，我們檢測(cè)了AT1R的下游MAPK信號(hào)通路主要蛋白的表達(dá)情況。在不同濃度的AngⅡ處理MCF-7細(xì)胞后，收集蛋白，用Western blot檢測(cè)ERK和p-ERK蛋白的表達(dá)水平。在不同濃度的AngⅡ處理下，ERK蛋白的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化；而p-ERK蛋白的表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性增加(0～10-7mol/L)，在10-7mol/L時(shí)，p-ERK蛋白的表達(dá)水平較空白組明顯增加(圖3)。結(jié)果提示，AngⅡ能夠激活ERK/MAPK信號(hào)通路。

2.4 AngⅡ通過(guò)ERK/MAPK途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖

為了研究ERK/MAPK是否在AngⅡ/AT1R介導(dǎo)的促細(xì)胞增殖效應(yīng)中起作用，本研究使用PD98059(一種MAPK抑制劑)處理MCF-7細(xì)胞，將其分為4組：空白組、AngⅡ組、PD98059組和AngⅡ+PD98059組。AngⅡ組的細(xì)胞增殖能力較空白組明顯提高(P=0.013)，AngⅡ+ PD98059組的細(xì)胞增殖能力較AngⅡ組顯著下降(P=0.017)。且PD98059組的細(xì)胞增殖能力也較空白組略微下降(P=0.023，圖4)。以上結(jié)果顯示，AngⅡ促乳腺癌細(xì)胞增殖作用與ERK/MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)，并可被MAPK抑制劑部分抑制。

圖1 CCK8法檢測(cè)AngⅡ?qū)CF-7細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 The proliferative ability of MCF-7 cells treated with Ang Ⅱ by CCK-8 method

圖2 CCK8法檢測(cè)氯沙坦對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig. 2 The proliferation of MCF-7 cells treated with losartan by CCK-8 method

圖4 CCK8法檢測(cè)MAPK抑制劑PD98059對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig. 4 The proliferative ability of MCF-7 cells treated with MAPK inhibitor-PD98059 detected by CCK-8 method

3 討 論

越來(lái)越多的研究證實(shí)，AngⅡ及ATIR在人類(lèi)多種腫瘤細(xì)胞及組織中高表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌、卵巢癌及宮頸癌等，且與腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)及不良預(yù)后密切相關(guān)［4］。一項(xiàng)研究報(bào)道使用免疫組化檢測(cè)AT1R蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯增高，進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系中AT1R的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MCF-7、T47D、MDA-MB-231細(xì)胞中均有表達(dá)，且MCF-7的表達(dá)量最高［3］。這些結(jié)果均提示AngⅡ及AT1R可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。Lewandowska等［5］的研究表明，AngⅡ可調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞的酪氨酸激酶活性，而酪氨酸受體EGFR在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，可調(diào)控多條信號(hào)通路，包括MAPK、PI3K/AKT及STAT3等。但是，MAPK信號(hào)通路是否參與AngⅡ/AT1R的促M(fèi)CF-7細(xì)胞增殖作用尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的AngⅡ?qū)θ橄侔┘?xì)胞MCF-7增殖能力具有不同的作用效果：較低濃度的AngⅡ(0～10-7mol/L)呈濃度依賴(lài)性增強(qiáng)其細(xì)胞增殖能力，而較高濃度的AngⅡ(10-6、10-5mol/L)反而使其細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)幅度明顯降低。究其原因，可能與較高濃度的AngⅡ作用下AT1R表達(dá)異常調(diào)節(jié)有關(guān)(如下調(diào)、內(nèi)在化及去偶聯(lián)等)，但具體機(jī)制尚不清楚。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ?qū)CF-7細(xì)胞的促增殖作用具有時(shí)間依賴(lài)性，且在24 h時(shí)作用最為顯著。這些結(jié)果與之前對(duì)AngⅡ促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的報(bào)道相一致［6］。那么，AngⅡ的促細(xì)胞增殖能力是否是由其主要效應(yīng)受體AT1R來(lái)介導(dǎo)的呢？胡麗娟等［7］用厄貝沙坦(一種AT1R阻滯劑)處理MCF-7，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AT1R介導(dǎo)AngⅡ的促細(xì)胞增殖能力，我們使用氯沙坦(另一種AT1R抑制劑，ARBs)處理細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)阻斷AT1R途徑，即使用氯沙坦能顯著抑制AngⅡ的促細(xì)胞增殖能力。這些結(jié)果均提示，AngⅡ通過(guò)AT1R來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力；而氯沙坦能夠有效抑制AngⅡ的這一作用。

我們接著研究了AngⅡ促乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的可能機(jī)制。ERK蛋白是MAPK信號(hào)通路中重要的下游效應(yīng)蛋白之一，激活后呈磷酸化的狀態(tài)，即p-ERK。本研究用Western blot檢測(cè)ERK及p-ERK蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，不同濃度的AngⅡ?qū)RK蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯作用，但能增加MCF-7細(xì)胞中磷酸化的ERK蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴(lài)性，在10-7mol/L時(shí)p-ERK的表達(dá)增加最為顯著，提示ERK/MAPK信號(hào)通路可能參與AngⅡ/AT1R介導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)。進(jìn)一步使用ERK/MAPK抑制劑PD98059處理細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了AngⅡ的促細(xì)胞增殖效應(yīng)能夠被顯著阻斷。這也與之前的研究結(jié)果相一致［3］，該研究證實(shí)AngⅡ激活Ras-Raf-MAPK信號(hào)通路，進(jìn)一步導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB和CREB的激活，最終導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實(shí)了AngⅡ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力，與AT1R/ ERK/MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)；選擇性地抑制AT1R或抑制ERK/MAPK信號(hào)通路均可阻斷AngⅡ的促細(xì)胞增殖作用。ARBs已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床治療高血壓、糖尿病及腎病等疾病，而最近美國(guó)食品藥品管理局(Food and DrugAdministration，F(xiàn)DA)的官方調(diào)查及新近兩篇Meta分析均證實(shí)，使用ARBs不會(huì)增加新發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)［8-9］。此外，Diop-Frimpong等［10］的研究結(jié)果顯示，氯沙坦還可抑制腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中膠原蛋白Ⅰ的產(chǎn)生，從而提高化療的療效。因此，將AT1R作為靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的靶向藥物的前景顯得更為廣闊，而ERK/MAPK信號(hào)通路涉及的因子較多，這也為基因治療提供了更多的靶點(diǎn)。

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The effects of angiotensin Ⅱ on the proliferation in human breast cancer cell line MCF-7 through AT1R/ERK/MAPK pathway

ZHONG Xiao-hong1,2, WU Xiao-an2, HU Bing1
(1.Cancer Institute of

Anhui Medical University Provincial Hospital, Hefei Anhui 230001, China; 2.Cancer Institute of People’s Liberation Army, 174 Hospital, Xiamen Fujian 361003, China)

HU bing E-mail: hubin3756@sina.com

Background and purpose: Studies have shown that renin-angiotensin system (RAS) is closely associated with tumor progress. angiotensinⅡ (AngⅡ) is the most important component of RAS. This study aimed to investigate the possible mechanism by which AngⅡ affected the cell proliferation in human breast cancer cell line MCF-7. Methods: CCK-8 was used to investigate the cell proliferation alteration of MCF-7 cells after treatment of AngⅡ at different dose and time. The in fl uence of losartan (an AT1R inhibitor) and PD98059 (a MAPK inhibitor) in AngⅡ-enhanced cell proliferation was detected by CCK-8. Protein expression was analyzed by Western blot. Results: AngⅡ stimulated the growth of breast cancer cells in a dose- and time-dependent manner. The maximal proliferation effect on MCF-7 cells was obtained with 10-7mol/L AngⅡ and 24 h, respectively (P＜0.000 1). Losartan signi fi cantly decreased the level of AngⅡ-induced proliferative effects (P＜0.05). Western blot showed that AngⅡ caused rapid activation of p-ERK. In addition, PD98059 could signi fi cantly suppress AngⅡ-promoted cell proliferation. Conclusion: AngⅡ can promote MCF-7 cell proliferation through AT1R/ERK/MAPK pathway activation, which could be reversed by losartan or PD98059. Therefore, targeting AngⅡ/AT1R/MAPK signaling could be a novel therapeutic for breast cancer.

Breast cancer; Angiotensin Ⅱ; AT1R; ERK1/2; Cell proliferation

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.09.003

R737.9

A

1007-3639(2014)09-0652-05

2014-05-27

2014-08-13）

“癌癥研究新視野大會(huì)”將于上海舉行

胡冰 E-mail:hubin3756@sina.com

由美國(guó)癌癥研究學(xué)會(huì)(American Association for Cancer Research，AACR)主辦的“癌癥研究新視野大會(huì)”將于2014年10月9-12日在上海金茂君悅大酒店舉行。本屆會(huì)議主題為“靶向治療的突破”，將著重介紹癌癥研究的主要領(lǐng)域中最新、最令人振奮的科研成果，并為世界各地的癌癥研究者們提供溝通交流和科學(xué)互動(dòng)的寶貴平臺(tái)，推動(dòng)癌癥科學(xué)與醫(yī)學(xué)的發(fā)展，促進(jìn)國(guó)際間合作。大會(huì)議程覆蓋了癌癥研究的全部領(lǐng)域，從基礎(chǔ)研究到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)，再到臨床，眾多國(guó)內(nèi)外知名專(zhuān)家教授將會(huì)呈上一場(chǎng)場(chǎng)精彩演講。同時(shí)我們還會(huì)帶來(lái)AACR 2014全球年會(huì)(2014年4月5-9日在圣地亞哥舉行)上的精彩內(nèi)容。更多詳情請(qǐng)登陸大會(huì)網(wǎng)站www.AACR.com.cn，聯(lián)系熱線86-21-23123591。