劉鳳杰 何向楠 王爭(zhēng)艷 莊義捷 王文鐸 鄭學(xué)玲 魯玉杰

（河南工業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心1，鄭州 450002）

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院2，鄭州 450002）

小麥粉中昆蟲蟲卵的檢測(cè)在小麥粉的進(jìn)出口貿(mào)易中，是一項(xiàng)重要指標(biāo)，建立一種快速檢測(cè)小麥粉中昆蟲蟲卵含量的方法是小麥粉產(chǎn)業(yè)中有待解決的問(wèn)題[1]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥粉中蟲卵的檢測(cè)主要用染色法[2-3]，浮選法[4]、尿酸法[5]、幾丁質(zhì)法[6]。浮選法已在美國(guó)AOCC中有詳細(xì)說(shuō)明，它是針對(duì)小麥粉中害蟲碎片的檢測(cè)，本研究用于蟲卵的檢測(cè)，判斷其可行性。

尿酸是昆蟲嘌呤代謝的主要終產(chǎn)物，為三氧基嘌呤，其醇式呈弱酸性，其合成是昆蟲代謝途徑的重要研究?jī)?nèi)容[7]。昆蟲分泌的尿酸作為氮代謝的最終產(chǎn)物，已用于昆蟲污染的指示物來(lái)檢測(cè)籽粒及谷物產(chǎn)品中昆蟲的數(shù)量[8]。幾丁質(zhì)（Chitin）是昆蟲體壁主要化學(xué)成分，占表皮干重的20%～50%[9]。在高溫和堿性條件下，幾丁質(zhì)脫去乙酰胺基形成幾丁糖，而幾丁糖經(jīng)碘和稀酸作用后呈紫色。純小麥粉中不存在幾丁質(zhì)，本試驗(yàn)根據(jù)該原理利用幾丁質(zhì)的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)小麥粉中是否含有蟲卵。染色法在生物科研領(lǐng)域應(yīng)用較多且較為成熟，但在儲(chǔ)藏物害蟲蟲卵的檢測(cè)應(yīng)用中尚處于初步研究試驗(yàn)中。研究表明對(duì)赤擬谷盜蟲卵有明顯染色效果的染色劑有溴甲酚綠、酸性品紅、橙黃 G[2]。本試驗(yàn)利用溴甲酚綠、酸性品紅作為主要染色劑對(duì)小麥粉中幾種甲蟲的卵進(jìn)行了檢測(cè)，比較檢測(cè)的適用性、經(jīng)濟(jì)性和應(yīng)用范圍，試圖找到一種快速、準(zhǔn)確地判斷小麥粉中蟲卵的檢測(cè)方法，以便在我國(guó)的小麥粉加工業(yè)推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

生化培養(yǎng)箱SPX-250B型：上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器HJ-3：國(guó)華電器有限公司；雙目立體顯微鏡SZM45-B1：舜宇有限公司；高速冷凍離心機(jī)KDL-160HR：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；T6新世紀(jì)系列紫外可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)材料

一級(jí)高筋粉：鄭州金苑面業(yè)有限公司；石蠟油：上海生物工程股份有限公司；碘（粒狀）、碘化鉀、酸性品紅指示劑：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚綠指示劑：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司

1.3 供試蟲卵

選取小麥粉中常見害蟲赤擬谷盜（Tribolium castaneum）作為蟲卵來(lái)源。赤擬谷盜蟲卵產(chǎn)生后帶有黏液，裏上小麥粉等碎屑后體積增大，能存留在100目谷物篩上。

小麥粉經(jīng)100目谷物篩過(guò)濾，以確保小麥粉干凈。挑選體表干凈、生命力強(qiáng)的赤擬谷盜，用過(guò)篩后小麥粉進(jìn)行飼養(yǎng)并在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)24 h進(jìn)行蟲卵采集。蟲卵暫存于培養(yǎng)皿中，待用。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 浮選法

由于首次采用浮選法檢測(cè)小麥粉中的蟲卵，所用蟲卵數(shù)量較多，將 7、14、28、56、112粒蟲卵分別放入5 g小麥粉中，每種蟲卵3個(gè)重復(fù)，共15個(gè)樣品，將小麥粉樣品放在250 mL的燒杯中，加入90 mL 3%的鹽酸溶液攪拌形成懸濁液，將混合物放在干燥箱中在121℃下干燥5 min。將混合液通過(guò)100目的濾網(wǎng)過(guò)濾，用自來(lái)水沖洗后轉(zhuǎn)移到100 mL的燒杯中，加入7.5 mL的石蠟油，將混合液放在磁力攪拌器上高溫?cái)嚢? min，然后將混合液轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝滿熱水的250 mL燒杯中，趁熱將溶液倒入250 mL分液漏斗中過(guò)濾，靜置30 min，在靜置的過(guò)程中間斷性搖晃。排除底層3 cm左右，重復(fù)排除底層操作2～3次直至底層的物質(zhì)被排除干凈。將分液漏斗中的溶液倒入250 mL燒杯中，量取3%的鹽酸溶液加到溶液中，然后將混合物放在磁力攪拌器上煮3～4 min。將混合液減壓抽真空過(guò)濾，將濾紙上的蟲卵轉(zhuǎn)移到凹盤中用雙目立體顯微鏡觀察并計(jì)算數(shù)量，檢測(cè)每5 g小麥粉中含有一定數(shù)量害蟲蟲卵的15個(gè)小麥粉試樣中存在的害蟲蟲卵的數(shù)量。

1.4.2 尿酸檢測(cè)法

FDA規(guī)定小麥粉蟲體碎片禁售水平為50 g小麥粉中75個(gè)昆蟲碎片，由于離心機(jī)及離心管規(guī)格所限，改進(jìn)為0.5 g小麥粉中加入 1、3、5、7、9、11粒蟲卵進(jìn)行試驗(yàn)。分析天平稱取18個(gè)0.5 g的小麥粉樣品，然后按照改進(jìn)加入不同數(shù)量的害蟲蟲卵放在小麥粉試樣中，每個(gè)蟲卵數(shù)量3個(gè)重復(fù)，混勻。

在6只試管中各加入含有1、3、5、7、9、11粒蟲卵的0.5 g小麥粉，加入2 mL蒸餾水、1 mL 0.1%碳酸鈉溶液；震蕩，形成懸濁液。轉(zhuǎn)移至離心管中，于10 000 r／min離心10 min，得到上清液。取上層清液0.5 mL加入另一離心管中，再加入4.5 mL鎢酸試劑，混勻后靜置5 min，重復(fù)所有測(cè)試組。將第二輪離心管于3 000 r／min離心5 min。另外制作標(biāo)準(zhǔn)管與空白管，將上清液換成0.3 mmol／L尿酸標(biāo)準(zhǔn)液與蒸餾水。再取8只離心管，各移入第二輪中離心管2.5mL上清液，并加入0.5mL 100 g／L碳酸鈉溶液，混勻，室溫靜置10 min；加入0.5 mL磷鎢酸應(yīng)用液，混勻，置室溫20 min。20 min后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度[12]。

通過(guò)比較吸光度，按經(jīng)驗(yàn)公式確定尿酸濃度。

測(cè)定組尿酸濃度（μmol／L）＝（測(cè)定組吸光度／標(biāo)準(zhǔn)組吸光度）×300

1.4.3 幾丁質(zhì)檢測(cè)法

幾丁質(zhì)法首次應(yīng)用于小麥粉中蟲卵的檢測(cè)，供試蟲卵數(shù)量應(yīng)較多，自備7、14、28、56、112粒蟲卵，每種蟲卵數(shù)量3個(gè)重復(fù)，共15個(gè)樣品。

1.4.3.1 幾丁質(zhì)定性測(cè)定

消化管制備：取試管1支，配以橡皮塞，在橡皮塞上打1個(gè)直徑約為5 mm的孔。插上玻璃管，橡皮塞外端的玻璃管上再連接1根橡皮管，長(zhǎng)30～50 cm，橡皮管的另一端再接1根一端拉細(xì)的開口的玻璃管，并將開口的玻璃管通入水槽內(nèi)，以防加熱時(shí)堿液濺出。取蟲卵適量，放入裝有8 mL飽和氫氧化鉀的試管中，塞緊帶有橡皮管的橡皮塞，置于甘油浴中加熱到160℃，保持15～20 min，由于蟲卵的大部分組織在高溫下被強(qiáng)堿消化，幾丁質(zhì)上乙?；幻撊?，得到透明薄膜狀的幾丁糖。

將各消化管內(nèi)未消化的物質(zhì)倒入小培養(yǎng)皿中，并用鑷子將其逐步移入95%、70%、50%、30%的酒精溶液中清洗，再用蒸餾水沖洗待用。

取一塊消化后的蟲卵（幾丁糖），置于白瓷點(diǎn)滴試驗(yàn)板上，加一滴0.03%碘—碘化鉀溶液，再加一滴1%硫酸，幾丁糖立即產(chǎn)生紫褐色反應(yīng)。如再加上數(shù)滴75%硫酸稍待片刻，紫色變淡直至消失，表明幾丁糖已在濃硫酸作用下完全水解。

1.4.3.2 幾丁質(zhì)定量測(cè)定

分別選取正常產(chǎn)出的蟲卵，按設(shè)定取一定數(shù)量的蟲卵分別在分析天平上稱重。

將已知質(zhì)量的蟲卵分別放入消化管中，按1.4.3.1方法裝入消化管，再加入5 g小麥粉混勻，在氫氧化鉀飽和溶液中加熱消化。

將消化后剩余的幾丁糖薄膜細(xì)心地倒在濾紙上，用緩慢的流水沖洗干凈，然后用95%、100%酒精脫水稱重。

幾丁質(zhì)相對(duì)含量＝消化后蟲卵（mg）／消化前蟲卵（mg）×1.26×A×100%

轉(zhuǎn)換系數(shù)A＝乙酰胺基葡萄糖分子質(zhì)量／氨基葡萄糖分子質(zhì)量

1.4.4 染色法

FAO規(guī)定小麥粉蟲體碎片禁售水平為50 g小麥粉中含有小于或等于75個(gè)昆蟲碎片，若將這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)用于蟲卵，按比例縮小，把 7、14、28、56、112粒蟲卵分別加入5 g小麥粉，混勻，每個(gè)蟲卵數(shù)量準(zhǔn)備3個(gè)重復(fù)，共15個(gè)樣品作為代檢驗(yàn)樣品。將完全混合后的的小麥粉樣品用100＃篩網(wǎng)篩選并收集小麥粉殘留物與蟲卵，小麥粉顆粒包裹的蟲卵轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中，并用2～3 mL乙醇潤(rùn)濕，然后加入5 mL稀硫酸（1∶19）后蓋上一培養(yǎng)皿，并保持10 min的蒸氣浴，產(chǎn)物通過(guò)布氏漏斗低壓抽濾。對(duì)于每一組，在無(wú)吸力的情況下加入10 mL染色劑（0.1%溴甲酚綠和0.05%酸性品紅）：2～3 min后，通過(guò)輕微的吸力將染色劑透過(guò)濾紙。后將濾紙轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用雙目顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)卵數(shù)。

1.4.5 4種檢測(cè)方法的驗(yàn)證

為了確定檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度，分別從鄭州金苑小麥粉廠和鄭州海嘉小麥粉廠隨機(jī)抽取了生產(chǎn)1周的特一粉和強(qiáng)筋小麥粉作為檢測(cè)樣品，在小麥粉袋的上、中、下部位進(jìn)行扦樣，每份60 g，均分成4份，每份再分成5 g的小份，每種方法3個(gè)重復(fù)，用浮選法、尿酸法、幾丁質(zhì)檢測(cè)法和染色法4種方法檢測(cè)小麥粉中有無(wú)蟲卵。同時(shí)把取樣的小麥粉放在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個(gè)月，利用篩網(wǎng)人工檢測(cè)小麥粉中幼蟲的數(shù)量作為實(shí)際蟲卵數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮選法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

浮選法檢測(cè)小麥粉中蟲卵的數(shù)量與理論放置的蟲卵的數(shù)量的相關(guān)性，如圖1所示。浮選法檢測(cè)小麥粉中蟲卵的最高檢測(cè)率僅為5.95%。

圖1 浮選法檢測(cè)蟲卵數(shù)量與理論放置蟲卵數(shù)的相關(guān)性分析

2.2 尿酸檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

尿酸法檢測(cè)尿酸濃度與小麥粉中蟲卵數(shù)量的關(guān)系，如圖2所示。從圖2中可以看出，尿酸檢測(cè)法能檢測(cè)出小麥粉中不同蟲卵量的尿酸濃度，且成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.998 6。

圖2 尿酸法檢測(cè)尿酸濃度與蟲卵數(shù)的相關(guān)性分析

2.3 幾丁質(zhì)檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

2.3.1 幾丁質(zhì)定性

按照試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，能夠觀察到圓點(diǎn)狀透明薄膜狀的幾丁糖漂浮在反應(yīng)溶液上（圖3）；按照試驗(yàn)方法進(jìn)行幾丁糖顯色反應(yīng)，可以明顯觀察到紫色絮狀物生成（圖4），可以認(rèn)定蟲卵中含有一定量的幾丁質(zhì)。

圖3 透明薄膜狀幾丁糖

圖4 幾丁糖顯色反應(yīng)

2.3.2 幾丁質(zhì)定量

反應(yīng)物于強(qiáng)堿環(huán)境中高溫加熱反應(yīng)，生成橘紅色黏稠物質(zhì)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)圓點(diǎn)狀幾丁糖薄膜；取生成物進(jìn)行幾丁糖顯色反應(yīng)，無(wú)紫色生成，說(shuō)明幾丁質(zhì)被消化完。此方法不能進(jìn)行定量試驗(yàn)，有待進(jìn)一步探討。

2.4 染色法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

采用不同染料的染色結(jié)果有顯著的區(qū)別，溴甲酚綠將蟲卵染成黃橙色（圖5），小麥粉染成褐綠色；酸性品紅將蟲卵與小麥粉染成紫色，蟲卵外觀近似透明，小麥粉相對(duì)顏色更深（圖6）。

圖5 利用溴甲酚綠染色劑對(duì)小麥粉中蟲卵染色的效果

圖6 利用酸性品紅染色劑對(duì)小麥粉中蟲卵染色的效果

不同的染料的顏色結(jié)果與理論蟲卵數(shù)有一定的相關(guān)性，如圖7所示。從圖7中可知溴甲酚綠染色結(jié)果檢測(cè)到的蟲卵數(shù)與理論蟲卵數(shù)的相關(guān)性回歸方程為y＝0.86x-1.791 3相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 6；酸性品紅染色結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的蟲卵數(shù)與實(shí)際蟲卵數(shù)相關(guān)回歸方程 y＝0.825 3x-3.615 8，相關(guān)系數(shù) R2＝0.997 9。

圖7 不同染色劑對(duì)小麥粉中蟲卵染色結(jié)果與理論蟲卵量的相關(guān)性分析

2.5 4種檢測(cè)小麥粉中蟲卵方法的比較

4種檢測(cè)方法各有利弊，為了便于進(jìn)一步研究，把不同方法的經(jīng)濟(jì)性、適用性和實(shí)用性等方面進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，浮選法僅僅適用于昆蟲碎片的檢測(cè)，而不適合檢測(cè)小麥粉中的卵。尿酸的檢測(cè)方法成本較低，結(jié)果較為準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于蟲卵的分析。

表1 小麥粉中幾種蟲卵檢測(cè)方法的比較

2.6 4種檢測(cè)方法檢測(cè)小麥粉中蟲卵結(jié)果的比較

利用4種檢測(cè)方法對(duì)2種不同生產(chǎn)廠家的小麥粉進(jìn)行檢測(cè)，并比較蟲害培養(yǎng)1個(gè)月后的結(jié)果，如表2所示。從表2可以看出，4種檢測(cè)方法中幾種尿酸檢測(cè)方法和染色法對(duì)小麥粉樣品可以檢測(cè)出來(lái)蟲卵的含量，與1個(gè)月的培養(yǎng)結(jié)果相比，檢出率分別達(dá)到73.3%和85%，說(shuō)明尿酸檢測(cè)方法和染色法可以初步用于小麥粉中蟲卵的檢測(cè)。

表2 4種檢測(cè)方法檢測(cè)隨機(jī)小麥粉中蟲卵的結(jié)果比較

3 討論

研究了用于檢測(cè)小麥粉中卵幾種方法，其中染色法和浮選法（FAO）雖然有過(guò)相關(guān)的研究[2-4]，但本研究采用了不同的染色劑進(jìn)行染色，并把用于檢測(cè)害蟲碎片的浮選法用于蟲卵的檢測(cè)。另外試驗(yàn)首次探索了利用害蟲的排泄物尿酸的尿酸檢測(cè)法和幾丁質(zhì)（昆蟲體壁的特殊結(jié)構(gòu)）檢測(cè)方法進(jìn)行小麥粉中卵的檢測(cè)的方法。

結(jié)果表明，浮選法在檢測(cè)小麥粉中的卵時(shí)，檢測(cè)效果比較低（不到10%），且沒(méi)有明顯的規(guī)律。FAO規(guī)定的小麥粉中昆蟲碎片的檢測(cè)可以用浮選法進(jìn)行，但根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果分析，并不適用于小麥粉中蟲卵的檢測(cè)。影響或誤差原因可能包括：蟲卵在3%鹽酸中、經(jīng)干燥箱121℃干燥加熱5 min以及高溫水浴都有可能造成蟲卵解體或溶解，造成試驗(yàn)結(jié)果偏低；蟲卵經(jīng)篩網(wǎng)篩選過(guò)程中，可能夾藏在網(wǎng)眼或縫隙中，造成試驗(yàn)結(jié)果偏低；蟲卵、水、石蠟油混合液在分液過(guò)程中可見蟲卵因石蠟油粘在分液漏斗壁上，造成試驗(yàn)結(jié)果偏低。適用于昆蟲碎片的檢測(cè)方法，用于蟲卵檢測(cè)可能導(dǎo)致蟲卵破碎，從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果較低。

尿酸檢測(cè)法中檢測(cè)到蟲卵尿酸的濃度隨蟲卵數(shù)增多而上升，成正相關(guān)。但增幅并不一致，造成該結(jié)果的原因可能包括：蟲卵大小不一，尿酸含量可能不同；檢測(cè)量較小，細(xì)微的小麥粉質(zhì)量差別或試劑劑量差別可能導(dǎo)致最終結(jié)果出現(xiàn)誤差。從驗(yàn)證的結(jié)果看該方法還需要進(jìn)一步的改進(jìn)。幾丁質(zhì)檢測(cè)方法通過(guò)檢測(cè)幾丁糖從而確定蟲卵所含幾丁質(zhì)的量，這種試驗(yàn)方法需要進(jìn)一步研究，目前不宜用于小麥粉中蟲卵的檢測(cè)。

染色方法中2種染色劑的染色效果接近，但都存在一定的誤差。染色法可將小麥粉和蟲卵染成不同的顏色，便于對(duì)比統(tǒng)計(jì)。但因?yàn)樾枰?jīng)過(guò)篩網(wǎng)過(guò)濾，對(duì)于蟲卵直徑有較高要求；對(duì)于已知害蟲種類的蟲卵，可以精確篩網(wǎng)尺寸，但對(duì)于不明確害蟲種類的蟲卵，篩網(wǎng)尺寸難以確定，進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程困難或檢測(cè)結(jié)果有較大偏差。染色法可以用于小麥粉中常見蟲卵檢測(cè)，但難以普及至全部害蟲蟲卵的檢測(cè)。

4 結(jié)論

浮選法可導(dǎo)致蟲卵破損和遺失，造成試驗(yàn)結(jié)果顯著偏低，即浮選法不適用于蟲卵的檢測(cè)。

幾丁質(zhì)檢測(cè)法只能對(duì)蟲卵含有的幾丁質(zhì)定性，但不能定量，所以此法不易用于小麥粉中蟲卵的檢測(cè)，需要進(jìn)一步研究；尿酸檢測(cè)法表明蟲卵尿酸濃度與蟲卵數(shù)成正相關(guān)，最低限能檢測(cè)到1 kg小麥粉中含有100粒蟲卵，尿酸檢測(cè)法可初步應(yīng)用于小麥粉中蟲卵的檢測(cè)，但需要進(jìn)一步研究；溴甲酚綠和酸性品紅染色劑可以將蟲卵與小麥粉染成不同的顏色，染色法可以初步用于小麥粉中常見害蟲蟲卵的檢測(cè)，但需要進(jìn)一步找到染色效果更加合適的染色劑。

[1]董秀麗，劉翠玲，吳勝男.小麥小麥粉中不安全因素測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，30（6）：80-84

[2]Leelaja BC，Rajashekar Y，Rajendran S.Detection of eggs of stored-product insects in flour with staining techniques[J].Journal of Stored Products Research，2007，43：206-210

[3]吳亞萍.小麥粉中常見的蟲害及潛在蟲害的檢測(cè)[J].現(xiàn)代小麥粉工業(yè)，2010（1）：53-55

[4]Glaze L E，Bryce JR.Extraction of light filth from whole wheat flour.Floatation method：collaborative study[J].Journal of AOAC International，1994，77：1150-1152

[5]朱光輝，葉恭銀，胡萃.用磷鎢酸還原法測(cè)定棕尾別麻蠅幼蟲尿酸[J].浙江大學(xué)昆蟲學(xué)報(bào)，2001，2：116-118

[6]駱焱平，鄭服從.農(nóng)藥學(xué)科群實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].?？冢汉Ｄ铣霭嫔纾?008

[7]丁萍，關(guān)魯雄，秦旭陽(yáng)，等，尿酸檢測(cè)方法及進(jìn)展[J].婁底師專學(xué)報(bào)，2004，（2）：8-12

[8]Ghaedian A R.昆蟲污染指示物一尿酸在小麥小麥粉擠壓中的穩(wěn)定性[J].王經(jīng)武譯.麥類作物，1996，73（5）：625-627

[9]肖業(yè)臣，羅曉斌，馮佩富，等.昆蟲幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)，2003，13（1）：38-39.