李海琳 劉京晶 朱國華 王軍峰 潘心禾

（浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地天然藥物研發(fā)中心1，臨安 311300）

（中國農業(yè)科學院茶葉研究所茶樹資源與改良研究中心2，杭州 310008）

（麗水市林業(yè)技術推廣總站3，麗水 323000）

（麗水市林業(yè)科學研究院4，麗水 323000）

油茶（Camellia oleifera Abel.），系山茶科山茶屬植物中油脂含量較高且有栽培經濟價值的一類植物的總稱[1]，是我國特有的木本油料樹種，具有很高的食、藥用價值。除水分外，油茶籽種仁主要由油分、淀粉、蛋白質、多糖、多酚類物質、黃酮類化合物、茶皂素和粗纖維組成，還有少量鞣質和灰分[2]。其中，黃酮類物質在抗氧化活性、防止皮膚疾病、增強免疫力和預防心血管疾病等方面具有重要的生物活性與功效，廣泛應用于食品、藥品、化妝品等產品中[3-5]。通常采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量，李姣娟等[6]、姜天甲等[7]分別用此方法測定了油茶葉和油茶籽殼中總黃酮含量；陳詩強等[8]采用三氯化鋁比色法測油茶籽中總黃酮含量；李利敏等[9]采用紫外直接測定法測定了油茶蒲中總黃酮含量。本研究從油茶餅粕中自制2種高純度黃酮苷作為對照品，建立其高效液相色譜含量測定方法。采用正交試驗法優(yōu)化了油茶籽種仁中2個單體黃酮苷的最佳提取工藝，并測定“長林”系列11個油茶品種。本研究的方法和結果為科學評價“長林”系列油茶提供參考，為油茶新品種選育及相關功能性食品或藥品的開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

“長林”系列11個品種油茶種籽均于2011年10月份采自浙江省麗水市油茶種質資源庫，剝除果皮和種殼，種仁于60℃干燥箱中烘干，粉碎過10目篩，干燥器中保存。除長林180號外，其余均已通過國家或省級良種審定[10]。

黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ對照品：自制，經面積歸一法檢測純度均大于98%；色譜乙腈：美國TEDIA天地試劑公司。

Agilet1200高效液相色譜儀：Agilent公司，含四元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶籽種仁提取方法的優(yōu)化

1.2.1.1 提取方式的選擇

通過比較油茶籽種仁中黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ的測定結果，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的回流提取法比超聲提取法要高，油茶籽種仁脫脂與否對2個主要黃酮苷含量測定結果無顯著影響，所以選擇不脫脂直接回流提取的方式。

1.2.1.2 提取溶劑的選擇

稱取油茶籽種仁粉末0.2 g，分別用50%、80%、100%的甲醇，50%、80%、100%的乙醇，50%的丙酮溶液20 mL作提取溶劑，于80℃水浴回流提取1 h，結果表明，50%甲醇溶液作提取溶劑時，黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ含量最高，所以初步選擇50%甲醇溶液作為提取溶劑。

1.2.1.3 正交試驗的設計

在提取方式和提取溶劑選擇的基礎上，進行正交試驗設計。采用回流提取方式，稱取0.2 g長林55號油茶籽種仁粉末于100 mL圓底燒瓶中，選取甲醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間為影響因素，按照L9（34）正交表設計試驗方案進行試驗，試驗因素水平及編碼見表1，運用高效液相色譜儀記錄油茶籽種仁提取液中2個主要黃酮苷的峰面積，計算2個黃酮苷的含量并以此作為考察指標，確定2個黃酮苷的最佳提取方法。

表1 因素水平表

1.2.2 2個單體黃酮苷的HPLC含量測定

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱：VenusilMPC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），線性梯度洗脫：0～30 min，5%～30%B；柱溫25℃；流速1.0 mL／min，檢測波長220 nm；進樣量10μL。在此條件下，2種成分的理論塔板數(shù)不低于20 000。

1.2.2.2 對照品的制備和鑒定

黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ的結構鑒定：從油茶餅粕中分離出的2個單體黃酮苷，經UV、H-NMR、CNMR、MS等數(shù)據分析，與文獻[11]比對一致，鑒定為山奈酚-3-O-｛β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷｝（Ⅰ）和山奈酚-3-O-｛β-D-吡喃木糖基-（1→2）-[α-L-吡喃鼠李糖基 -（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷｝（Ⅱ），結構式見圖1。

圖1 黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ結構式

對照品溶液的配制：稱取黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ對照品適量，用甲醇配成質量濃度分別為0.53 mg／mL和0.52 mg／mL的混合溶液，置冰箱中備用。

1.2.2.3 供試品溶液的制備

稱取油茶籽種仁粉末0.2 g，置于100mL圓底燒瓶中，精密加入10 mL 80%甲醇，稱定質量，于80℃水浴回流提取1 h，放冷稱定，補足減失的質量，搖勻，經0.45μm有機微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.4 線性關系考察

吸取對照品溶液0.5、1、2、4、8、10、15μL注入高效液相色譜儀，依據上述色譜條件進行測定，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線見表2。

表2 標準曲線和線性范圍

1.2.2.5 方法學考察

1） 精密度試驗

吸取對照品溶液10μL按1.2.2.1色譜條件重復進樣6次。結果表明，黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.89%和0.76%，表明儀器精密度良好。

2） 穩(wěn)定性試驗

吸取同一供試品溶液10μL，按1.2.2.1色譜條件，依次在0、2、4、6、8、12、24 h進樣，結果黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.37%和0.43%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

3） 重復性試驗

稱取同一批樣品（長林3號）6份，分別按2.2.3制備供試品溶液，按1.2.2.1色譜條件測定。結果，黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ峰面積的RSD分別為1.04%和1.07%，表明方法重復性良好。

4） 回收率試驗

取0.1 g已知含量的樣品9份，精密稱定，分別精密加入高、中、低3個劑量的黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ對照品溶液，按1.2.2.1色譜條件進行測定。加樣回收率按以下公式計算：

回收率＝（實測量-樣品中含量）／加入對照品量×100%

2個對照品成分加樣回收率分別為97.3%～98.9%（RSD＜1.95%）和96.8%～98.9%（RSD＜1.55%），結果見表3。

表3 “長林”系列油茶籽種仁中2個單體黃酮苷的加樣回收率

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果與分析

正交試驗結果見表4，由表4可知，4個因素對2個黃酮苷含量的影響大小均為：甲醇體積分數(shù)＞液料比＞提取溫度＞提取時間，并且甲醇體積分數(shù)50%，料液比1∶50，提取時間90 min，提取溫度80℃時測得2個黃酮苷含量最高。結合方差分析和顯著性檢驗可知，甲醇濃度對黃酮苷提取影響極顯著，但在50%和80%水平時差異不顯著，考慮到50%提取液略顯乳濁狀，故甲醇體積分數(shù)定為80%；液料比對2個黃酮苷的提取影響極顯著，仍定為測得含量最高的1∶50；提取時間對2個黃酮苷的提取影響不顯著，故60 min較為合適；提取溫度對黃酮苷Ⅰ的提取影響不顯著，對黃酮苷Ⅱ的提取影響顯著，80℃有利于2個黃酮苷的提取。所以最終確定2個黃酮苷的最佳提取工藝為A2B3C1D2，即甲醇體積分數(shù)80%，料液比1∶50，提取溫度80℃，提取時間60 min。

表4 正交試驗結果

2.2 HPLC含量測定結果與分析

按1.2.2.1色譜條件進行測定，以外標法計算“長林”系列11個不同品種油茶籽種仁中黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ的含量，結果見表5。由表5可知，2個黃酮苷質量分數(shù)分別為1.28%～2.98%和1.42%～2.37%，在不同品種油茶中存在顯著差異，其中黃酮苷Ⅰ以長林53號、55號和21號最高，長林40號次之，長林23號最低；黃酮苷Ⅱ以長林4號、27號和18號最高，長林23號次之，長林180號、53號最低。油茶籽種仁中總黃酮質量分數(shù)為3.57%～4.69%，以長林4號、21號和55號最高，長林18號最低。2個黃酮苷含量呈顯著負相關，2個主要黃酮含量的總和分別與2個單體黃酮的質量分數(shù)沒有顯著相關性，可見不能以某一單體黃酮的含量代表該品種油茶籽的黃酮總體含量情況。

由HPLC圖（譜圖2b）可明顯看出油茶籽種仁中最主要的黃酮苷類成分為黃酮苷Ⅰ和黃酮苷Ⅱ，李海琳等[12]前期研究中對油茶籽種仁的總黃酮采用通用的亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，結果質量分數(shù)為0.53%～1.06%，低于本研究HPLC法所測2個黃酮苷含量總和（3.57%～4.71%）。原因是油茶籽種仁中以山奈酚為母核的黃酮苷類化合物不能與亞硝酸鈉-硝酸鋁試劑反應生成黃色絡合物（以黃酮苷Ⅰ標準品溶液進行該顯色反應試驗，以溶劑為空白對照，在510 nm波長處測定吸光度值約為0），因此，以蘆丁為對照品的亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法不能準確定量油茶籽種仁中總黃酮含量。

圖2 對照品和油茶籽種仁的HPLC圖

3 結論

本研究考察了提取方式（超聲提取、回流提?。?個黃酮苷提取得率的影響，結果表明回流提取的效果明顯高于超聲提取。繼而設計L9（34）正交試驗并對結果進行統(tǒng)計學分析，選擇80%甲醇溶液，料液比1∶50，溫度80℃，回流提取時間1 h為油茶籽種仁中主要黃酮苷的最佳提取工藝。采用Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，乙腈 -0.1%磷酸水溶液流動相，線性梯度洗脫，流速1.0 mL／min，檢測波長220 nm，柱溫25℃，建立了2個主要黃酮苷的HPLC含量測定方法。結果表明11個品種油茶籽種仁中黃酮苷Ⅰ質量分數(shù)為1.28%～2.98%，黃酮苷Ⅱ質量分數(shù)為1.42%～2.37%。本試驗建立的HPLC法專屬性強、準確度高、重復性好，可用于油茶品種間黃酮含量的品質評價。

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