于存等

摘要

[目的]明確白靈菇（Pleurotus ferulae）分泌木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）、錳過(guò)氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）的規(guī)律，以及白靈菇染料脫色的能力。[方法]利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，檢測(cè)4種培養(yǎng)方式下白靈菇木質(zhì)素降解酶活性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了白靈菇對(duì)5種染料的脫色研究。[結(jié)果] 4種培養(yǎng)方式下，可以檢測(cè)到MnP和Laccase的活性，但并未檢測(cè)到LiP。添加Mn2+和2，6二甲氧基苯酚（2，6DMP）對(duì)MnP和Laccase的產(chǎn)生有抑制作用，而添加青楊木屑可以將MnP的活性提高1.28倍，將Laccase的活性提高3.75倍；白靈菇對(duì)中性紅和活性黑2種染料的最大脫色率分別為87.12%和86.13%，對(duì)活性紅和剛果紅的最大脫色率分別為45.91%和32.28%，而對(duì)結(jié)晶紫幾乎無(wú)脫色能力。[結(jié)論] 白靈菇產(chǎn)Laccace活性要高于MnP；與脫色活性紅、剛果紅、結(jié)晶紫相比，白靈菇對(duì)中性紅和活性黑2種染料的脫色更為徹底。

關(guān)鍵詞白靈菇；錳過(guò)氧化物酶；漆酶；木質(zhì)素過(guò)氧化物酶；染料脫色

中圖分類號(hào)S646文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2014）06-01784-04

Abstract [Objective] The research aimed to understand the activities of Lignin Peroxidase， Manganese Peroxidase and Laccase of Pleurotus ferulae， and research the decolorization capacities on dyes by P. ferulae. [Method] By using UV/Vis spectrophotometer， the activities of ligninolytic enzymes of P. ferulae in four different culture conditions were detected. Furthermore， the decolorization capacities on five kinds of dyes by P. ferulae were studied. [Result] MnP and Laccase activity were detected without LiP in four different culture conditions. Adding Mn2+ and 2， 6DMP in the culture can inhibit the production of MnP and Laccase. By adding Populus ussuriensis wood chips， the capacity of MnP was improved by 1.28 times， and the capacity of Laccase was improved 3.75 times； that neutral red and reactive black were decolorized by P. ferulae effectively， the maximum decolorization ratio reached 87.12% and 86.13% respectively， and followed by reactive red and congo red， the maximum decolorization ratio was 45.91% and 32.28% respectively. In addition， there was hardly decolorization ability on crystal violet. [Conclusion] Producing of Laccase by P. ferulae is higher than MnP； decolorized of followed and reactive red more than thorough decolorized of neutral red and reactive black by P. ferulae.

Key words Pleurotus ferulae； Manganese Peroxidase； Laccase； Lignin Peroxidase； Dyes decolorization

白腐真菌 （whiterot fungi） 通過(guò)分泌木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、錳過(guò)氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）和漆酶（Laccase）3種主要的木質(zhì)素降解酶系，可以有效降解有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、鹵素、合成染料等眾多難降解的污染物[1-6]。

全世界每年大約生產(chǎn)8×105 t染料，其中至少有10%的染料進(jìn)入到自然水體中[7]，這些染料不僅對(duì)自然界水體造成污染，還能直接或間接地對(duì)人體造成危害。目前，染料廢水主要的處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法，一般來(lái)說(shuō)物理和化學(xué)方法對(duì)染料廢水的處理率較高，但是存在操作不便且可能產(chǎn)生二次污染的缺點(diǎn)。而與物理和化學(xué)法相比，生物法具有處理量大且不產(chǎn)生二次污染的優(yōu)點(diǎn)。白腐真菌作為微生物中的一大類群，由于可分泌漆酶 （Laccase）、過(guò)氧化物酶 （LiP） 和錳過(guò)氧化物酶（MnP）等多種胞外酶系及自身結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，其在染料脫色方面的重要作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)越來(lái)越多地受到人們的關(guān)注，成為生物法處理染料廢水研究中的熱點(diǎn)[8]。

白靈菇（Pleurotus ferulae Lanzi） 隸屬于真菌界擔(dān)子菌門傘菌綱傘菌目側(cè)耳科，是一種含有豐富多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素、食用纖維、多種礦物元素和微量元素的藥食兩用大型白腐真菌[9-10]。以往在其栽培、儲(chǔ)運(yùn)保鮮、分類、營(yíng)養(yǎng)成分分析、多糖提取和食藥用價(jià)值等方面已有大量報(bào)道[11-18]，但是對(duì)白靈菇木質(zhì)素降解酶活性及其在染料脫色方面的研究，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。筆者檢測(cè)了不同底物作用下白靈菇分泌木質(zhì)素降解酶的能力，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了白靈菇對(duì)5種染料的脫色研究，從而為今后深入研究白靈菇木質(zhì)素酶系統(tǒng)降解芳香族化合物的作用機(jī)制，及白靈菇在染料廢水脫色方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來(lái)源。

白靈菇子實(shí)體采于黑龍江省伊春市東北林業(yè)大學(xué)涼水實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，菌絲體保存于東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科森林病蟲病理實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱斜面培養(yǎng)基，試驗(yàn)前截取斜面培養(yǎng)基的小塊菌絲接種于PDA平皿上，29 ℃活化10 d。

1.1.2培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯煮沸30 min后，添加20 g葡萄糖和15 g瓊脂粉，加水定容至1 L。PDB培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯煮沸30 min后，添加20 g葡萄糖，加水定容至1 L。

2結(jié)果與分析

2.1白靈菇4種培養(yǎng)方式下LiP活性的測(cè)定

4種不同培養(yǎng)方式下對(duì)白靈菇產(chǎn)LiP的酶活進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在21 d內(nèi)均未檢測(cè)到吸光值的變化，表明白靈菇在4種培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生LiP。

2.2白靈菇4種培養(yǎng)方式下MnP活性的測(cè)定

4種培養(yǎng)方式下21 d內(nèi)白靈菇產(chǎn)MnP的結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，4種培養(yǎng)方式下白靈菇均能產(chǎn)生MnP，且MnP活性呈先升高后

降低再升高的波動(dòng)性變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)方式A、B、D之間的產(chǎn)酶能力及酶活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)相似，都是在接入菌絲塊的第3天時(shí)就能檢測(cè)到MnP活性，且隨時(shí)間的推移酶活性逐漸增加，直至第7天時(shí)酶活性達(dá)到最大，A、B、D對(duì)應(yīng)的酶活性分別為13.28、10.47、9.07 U/L，之后酶活性均低于第7天，且呈現(xiàn)酶活性先降低再升高再降低的波動(dòng)性變化。與A、B、D產(chǎn)酶不同，培養(yǎng)方式C在第9天時(shí)才出現(xiàn)一個(gè)酶活性高峰，酶活性為15.73 U/L，且酶活性在21 d內(nèi)的酶活性曲線除第7天低于培養(yǎng)方式A外，其他時(shí)刻均高于其他3種培養(yǎng)方式下的MnP活性；2.3白靈菇4種培養(yǎng)方式下Laccase活性的測(cè)定

由于在小分子介體物質(zhì)的存在下，Laccase可以氧化多種非酶底物的特性，其在食品和環(huán)保工業(yè)上的應(yīng)用研究日益活躍[21]。4種培養(yǎng)方式下白靈菇產(chǎn)Laccase隨時(shí)間變化結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，4種培養(yǎng)方式下均能產(chǎn)生Laccase。培養(yǎng)方式A、B、D產(chǎn)酶能力接近，酶活性排序?yàn)锳>D>B，表明添加Mn2+和2，6-DMP抑制了白靈菇產(chǎn)Laccase。培養(yǎng)方式C對(duì)應(yīng)的Laccase活性明顯高于A、B、D，表明添加青楊木屑可以顯著提高白靈菇產(chǎn)Laccase的能力。另外，觀察產(chǎn)Laccase隨時(shí)間的變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)方式A與C變化趨勢(shì)相似，在3 d時(shí)開始產(chǎn)生酶活性，并隨時(shí)間的推移逐漸增加，直至第9天后，酶活性出現(xiàn)波動(dòng)性變化，至第17天酶活性有較大程度的提高且在19～21 d的酶活性維持在較高的水平，表明添加木屑并沒(méi)有改變白靈菇產(chǎn)Laccase的趨勢(shì)。A與C方式下最大酶活性分別出現(xiàn)在17 d和21 d，酶活性分別為39.67 U/L和 148.27 U/L，添加青楊木屑酶后Laccase活性提高了3.75倍；與A、C酶活變化趨勢(shì)不同，B與D產(chǎn)Laccase的變化趨勢(shì)相似，呈先升高分別在第5天和第7天達(dá)到酶活性最大值，酶活性分別為17.90 U/L和21.92 U/L，之后呈連續(xù)下降再升高的波動(dòng)性變化。

是在3 d產(chǎn)生，然后迅速的升高，到7～9 d達(dá)到一個(gè)高峰值或者最大值，以后會(huì)迅速下降到一個(gè)較低值，然后緩慢地呈現(xiàn)升高之后下降再升高的波動(dòng)趨勢(shì)。Laccase的變化曲線同樣在第3天產(chǎn)生，然后迅速升高，在7～9 d時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值或最大值，之后呈現(xiàn)下降再升高的變化趨勢(shì)，在17～21 d出現(xiàn)一個(gè)峰值或最大值。這與迷宮栓孔菌 （Trametes gibbosa）產(chǎn)酶不同[5]，酶活曲線變化相對(duì)更為復(fù)雜一些。試驗(yàn)結(jié)果表明，白靈菇產(chǎn)MnP和Laccase過(guò)程中Mn2+不是必需因子，在有無(wú)Mn2+的條件下均能產(chǎn)生酶活性，最大酶活量在加入Mn2+后有較小程度的下降。在培養(yǎng)過(guò)程中以木屑作為酶作用底物可以促進(jìn)MnP和Laccase的分泌。而添加2，6DMP作為白靈菇產(chǎn)酶的底物對(duì)MnP和Laccase的產(chǎn)生有一定的抑制作用。圖3為不同培養(yǎng)方式下MnP和Laccase在21 d內(nèi)最大酶活性的比較，由圖3可知，在各處理下Laccase酶活性都要高于MnP，分析這種差異，可能與氧化不同底物進(jìn)行酶活性測(cè)定的方法有關(guān)，也可能在降解芳香族化合物的過(guò)程中Laccase要發(fā)揮更大的作用，從而分泌量更大。

2.5白靈菇對(duì)5種染料的脫色

多數(shù)真菌既有吸附染料又有降解染料的功能[24]。在白靈菇木質(zhì)素降解酶系檢測(cè)的基礎(chǔ)上，為驗(yàn)證其染料脫色的能力，進(jìn)行了白靈菇對(duì)3種不同結(jié)構(gòu)類型的5種染料脫色的研究。該項(xiàng)試驗(yàn)首先以1 ml去離子水作為對(duì)照，在300～800 nm范圍內(nèi)對(duì)50 mg/L的5種染料進(jìn)行染料最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為：活性黑 （λmax=595 nm），活性紅 （λmax=539 nm），剛果紅 （λmax=501 nm），結(jié)晶紫 （λmax=584 nm）和中性紅（λmax=528 nm）。白靈菇對(duì)5種染料11 d內(nèi)的脫色效果見(jiàn)圖4。由圖4可知，除結(jié)晶紫幾乎無(wú)脫色外，白靈菇對(duì)活性黑、活性紅、剛果紅、中性紅均能產(chǎn)生一定的脫色。脫色1 d后對(duì)活性黑脫色最為徹底，脫色率為60.79%，活性紅、剛果紅和中性紅依次減弱，脫色率分別為29.70%、20.09%、17.52%。1～5 d，除中性紅染料的脫色率顯著增加外，活性黑、活性紅、剛果紅染料的脫色率緩慢增加，且始終呈現(xiàn)脫色率活性黑>活性紅>剛果紅。5 d后幾種染料脫色率達(dá)到較高水平，上下波動(dòng)不大，且呈現(xiàn)脫色率中性紅>活性黑>活性紅>剛果紅。活性黑、活性紅、剛果紅、中性紅出現(xiàn)最大脫色率的時(shí)刻及脫色率分別為：活性黑 9 d，86.13%；活性紅7 d，45.91%；剛果紅5 d，32.28%；中性紅 9 d，87.12%。綜合以上結(jié)果，白靈菇對(duì)雜環(huán)類染料中性紅、偶氮類染料活性黑有較強(qiáng)的脫色能力，對(duì)偶氮類活性紅和剛果紅脫色能力次之，而對(duì)三苯甲烷類染料結(jié)晶紫無(wú)脫色能力。

3結(jié)論與討論

大多數(shù)白腐菌僅產(chǎn)生2種甚至1種分解木質(zhì)素的酶，如鮮紅密孔菌 （Pycnoporus cinnabarinus）只分泌Laccase，而不產(chǎn)生LiP和MnP，因此這3種酶在分解木質(zhì)素的過(guò)程中并不是全都必需的[23-24]。該研究通過(guò)檢測(cè)4種培養(yǎng)方式下白靈菇分泌LiP、MnP和Laccase的能力，發(fā)現(xiàn)白靈菇可以產(chǎn)生MnP和Laccase，但并不產(chǎn)生LiP。MnP和Laccase的活性受包含碳源種類、氮源種類、金屬離子、誘導(dǎo)劑等多項(xiàng)培養(yǎng)條件及環(huán)境因子的影響[25-26]。Mn2+是白腐菌產(chǎn)MnP的必要因子，添加2，6-DMP作為產(chǎn)酶底物可以促進(jìn)MnP和Laccase的分泌[20，24]。該研究在不添加Mn2+的培養(yǎng)方式下同樣能檢測(cè)到MnP的分泌，表明Mn2+不是白靈菇產(chǎn)MnP的必要因子。添加Mn2+和2，6-DMP對(duì)MnP和Laccase的產(chǎn)生有微弱抑制作用，而添加青楊木屑可以顯著提高2種酶的活性。

白腐菌除了通過(guò)分泌胞外酶的降解作用進(jìn)行染料脫色外，還通過(guò)菌體自身結(jié)構(gòu)與染料相契合的吸附作用進(jìn)行脫色，且由于不同種類染料的結(jié)構(gòu)各不相同，因此脫色效果也會(huì)存在顯著差異[1，27]。該研究中白靈菇可對(duì)中性紅和活性黑2種染料有效脫色，脫色率高達(dá)87.12%和86.13%，對(duì)活性紅和剛果紅脫色次之，脫色率僅為45.91%和32.28%，而對(duì)結(jié)晶紫幾乎不脫色。

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