劉勇

摘 要：肌細(xì)胞生成素在肌細(xì)胞的分化過程中起著關(guān)鍵的正向調(diào)節(jié)作用。根據(jù)豬的肌細(xì)胞生成素的基因序列設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物，以山西黑豬為研究對象，通過PCR擴(kuò)增，獲得長度為1 493 bp的序列，經(jīng)測序和基因的同源性比對得出山西黑豬的基因序列與家豬等動物有較高的同源性。結(jié)果表明：肌細(xì)胞生成素基因可能在山西黑豬肌肉組織發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。為今后改良黑豬的肌肉品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：山西黑豬；肌細(xì)胞生成素；擴(kuò)增；應(yīng)用

中圖分類號：S828.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）06-0055-02

1 材料與方法

1.1 組織材料及試劑

1.1.1 材料

山西黑豬一頭，來自山西省原平市，取其腿部肌肉一塊，迅速投入液氮。用于RNA的提取。

1.1.2 主要試劑

Trizol 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA MarkerDL2000和Rnase抑制劑均購自大連TaKaRa公司。

1.2 RNA提取

將凍存于液氮的山西黑豬退腿部肌肉在液氮中研磨成粉后，按照Trizol試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟提取山西黑豬肌肉中的總RNA，用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢查提取的RNA的完整性，使用微量核酸蛋白測定儀測定其濃度。并將其歸為500 ng/μL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的PCR擴(kuò)增。

1.3 引物設(shè)計(jì)

對GeneBank中登錄豬的肌細(xì)胞生成素（myogenin）序列（X89007.1、AY912514.1和AY912513.1）進(jìn)行同源性比較，借助Primer5.0 plus軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增山西黑豬肌細(xì)胞生成素1對特異性引物，預(yù)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 493 bp，引物序列為： F： gtgcctgcctttgttagagc；R： catcctggcagacagtctca。由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增

將提取的山西黑豬肌肉的總RNA，按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，以特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：cDNA 2 μL、特異上下游引物各0.5 μL、TaqE 0.25 μL、dNTP 2 μL、10×buffer 2.5 μL、無菌水17.25 μL，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s， 72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠、回收、純化后送交大連寶生物工程有限公司雙引物測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見與預(yù)期大小相符的特異性條帶（圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

3 討論

山西黑豬是由巴克夏豬、 內(nèi)江豬、山西本地豬雜交培育而成?，F(xiàn)主要分布在大同、原平、河曲、五臺和太谷等市縣。其全身為黑色，繁殖力較高，抗逆性較強(qiáng)，耐粗飼生長速度快[1]。作為地方品種，挖掘其肉用方面的優(yōu)勢，提高其飼養(yǎng)量和生產(chǎn)量勢在必行。因此，運(yùn)用分子生物學(xué)手段，克隆產(chǎn)肉量和肉質(zhì)相關(guān)基因的序列，現(xiàn)實(shí)山西黑豬的肉質(zhì)改良是可行有效的方法。

肌肉的發(fā)育過程是一個復(fù)雜的生理過程，受眾多的正向和負(fù)向調(diào)控因子的共同調(diào)控，其中生肌調(diào)節(jié)因子家族在肌肉發(fā)育過程中起著重要的正調(diào)控作用，并且控制著肌肉發(fā)育的整個過程。肌細(xì)胞生成素是生肌調(diào)節(jié)因子MYOD家族成員之一，在肌細(xì)胞的分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，目前它是研究畜禽肉質(zhì)性狀的一個重要候選基因[2-4]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1對特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1 493 bp的基因序列，與家豬、野豬、牛、馬、羊的同源性比較，同源性分別為：100 %、99 %、99 %、97 %?！酢?/p>

參考文獻(xiàn)：（4篇，略）