周 衛(wèi)，蔡 燕，劉青松，蔣 紅，邢 艷

(1.川北醫(yī)學(xué)院2008 級碩士研究生，四川 南充 637000;2.四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，四川 綿陽 621000;3.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000;4.川北醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所，四川 南充 637000 )

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系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種與多種因素相關(guān)的自身免疫性疾病，病變累及多系統(tǒng)、多器官，其病因及發(fā)病機制尚未完全明確。很早人們就觀察到女性更易罹患該病，并且月經(jīng)周期、妊娠、避孕藥對SLE 的疾病狀態(tài)有著明顯影響，活動的SLE 血清中E2可增高［1］，其代謝產(chǎn)物如2-羥雌酮、16-α 羥雌酮也存在比例失衡［2］，性激素尤其雌激素在SLE 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［3］。本研究通過檢測SLE 患者PBMCs 中ERα、ERβ 的表達率，探討ER 亞型與SLE 的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取我院2009 年12 月至2010 年6 月住院及門診SLE 女性患者46 例，其診斷均符合1982 年美國風(fēng)濕病協(xié)會修訂的紅斑狼瘡診斷標(biāo)準，平均年齡(36.1 ± 12.4)歲。健康體檢者33 例，平均年齡(37.8 ±13.9)歲，入選者均無其他風(fēng)濕性、內(nèi)分泌性和代謝性疾病。

1.2 主要試劑和儀器

TRIZOL 試劑、2 × Taq PCR MasterMix(北京天根生物技術(shù)有限公司)，焦碳酸二乙酯處理水(Sigma 公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(成都博瑞克生物技術(shù)有限公司)，兔抗人ERα、ERβ(Santa 公司)，熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋，進口分裝)，PCR 儀、凝膠成像儀、電泳儀(Bio-Rad 公司)，熒光顯微鏡(Olympus 公司)。

1.3 ER 基因水平的檢測

1.3.1 RNA 的提取及cDNA 的合成 取肝素抗凝的外周靜脈血4 mL，用Ficoll 密度梯度離心法分離PBMCs。TRIZOL 法提取細胞總RNA。cDNA 合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。

1.3.2 PCR 反應(yīng) 總體積為25 μL:cDNA 模板為4 μL，2 ×MasterMix 12.5 μL，雙蒸水7.5 μL，上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性45 s，ERα 62 ℃退火45 s，ERβ 60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)45 次;末次循環(huán)72 ℃5 min。引物由上海生物工程公司合成，ERα 引物:sense 5’-atcctgatgattgttctcgtct-3’，antisence 5’-ggatatggtccttctcttccaga-3’，擴增產(chǎn)物長度為271 bp;ERβ 引物:sense 5’-gctcatctttgctccagatcttg-3’，antisence 5’-caatcacccaaaccaaagcatc-3’，擴增產(chǎn)物長度為266 bp。以管家基因β-actin 作為內(nèi)參，引物分別為:sense 5’-gagctacgagctgcctgacg-3’，antisence 5’-gtagtttcgtggatgccacag-3’，產(chǎn)物長度為120 bp。

1.3.3 PCR 擴增產(chǎn)物電泳 取6 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳20 min，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描，出現(xiàn)肉眼可辨的清晰條帶為陽性。

1.4 ER 蛋白水平的檢測

1.4.1 制備細胞甩片 取肝素抗凝的外周靜脈血2 mL，用Ficoll 密度梯度離心法常規(guī)分離PBMCs，將細胞懸液密度調(diào)整為1 ×10－6，制備細胞甩片，待自然干燥后，用4%多聚甲醛固定，－30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 免疫熒光法檢測PBMCs 中ER 的表達 取出凍存的細胞甩片，室溫復(fù)溫1 h，PBS 緩沖液洗3次，每次5 min;0.5%triton 溶液37℃透膜25 min，再洗3 次;在37 ℃用3%BSA、5%脫脂奶粉各封閉30 min，加1∶100 稀釋的兔抗人ERα、ERβ 在4 ℃孵育過夜。次日復(fù)溫30 min，緩沖液洗3 次，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育40 min，洗3 次，甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察，抗體均用3%BSA 按1∶100 稀釋。

1.4.3 結(jié)果判定 細胞無熒光為陰性，呈黃綠色或亮綠色熒光為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，χ2檢驗及確切概率法分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

雌激素受體在PBMCs 中的表達類型有3 種:同時表達ERα 和ERβ(ERα +ERβ)，只表達ERα，只表達ERβ。

2.1 PBMCs 中ER mRNA 的表達

經(jīng)1.5% 瓊脂糖電泳，β-actin、ERβ、ERα PCR產(chǎn)物均得到明顯而單一的條帶，如圖1 所示。

圖1 M 為DNA Marker （100~600 bp），梯度為100 bp，Lane1-lane3 分別為SLE 患者PBMCs 內(nèi)β-actin、ERβ、ERα 產(chǎn)物

RT-PCR 檢測到SLE 組和對照組PBMCs 中ERα mRNA、ERβ mRNA、(ERα mRNA + ERβ mRNA)和陰性表達的例數(shù)見表1。

表1 SLE 組與對照組ER mRNA 表達比較

統(tǒng)計分析顯示，SLE 組和正常對照組PBMCs 中ER mRNA 的表達沒有顯著差異(P ＞0.05)。

2.2 PBMCs 中ER 在蛋白水平的表達

間接免疫熒光法檢測到SLE 組ERs 陽性表達35 例，陰性11 例;對照組ERs 陽性表達21 例，陰性12 例。如圖2 ～4 所示。

圖2 SLE 患者PBMCs 內(nèi)ERs 表達陰性

圖3 SLE 患者PBMCs 內(nèi)ERα 表達陽性

圖4 SLE 患者PBMCs 內(nèi)ERβ 表達陽性

SLE 組和對照組PBMCs 中ERα、ERβ 蛋白表達情況，見表2?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示，SLE 組和正常對照組ER 在蛋白水平的表達無顯著性差異(P ＞0.05)。

表2 SLE 組與對照組ER 蛋白表達比較

3 討論

SLE 好發(fā)于女性且疾病活動度隨女性生理周期、妊娠而變化，說明性激素及其受體在SLE 的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用。目前普遍認為雄激素是天然的免疫抑制劑，而雌激素是體液免疫增強劑。雌激素是一種類固醇激素，與多個系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)，其中雌二醇(estradiol，E2)的作用尤為重要。

雌激素的靶細胞可以是T、B 淋巴細胞、NK 細胞、單核－巨噬細胞、樹突狀細胞等，這些細胞參與SLE 的病理過程。雌激素通過與靶細胞的受體結(jié)合發(fā)揮生理效應(yīng)，ER 包括雌激素核受體和膜表面相關(guān)受體。雌激素核受體屬于類固醇激素核受體超家族，目前發(fā)現(xiàn)有ERα、ERβ 兩種亞型［4］，它們由不同的基因編碼，具有不同的組織特異性，其中ERβ 具有更為廣泛的組織分布［5］。它們可以共表達亦可單獨表達，更多是呈共表達并形成功能性的同型二聚體和異二聚體，形成異二聚體尤甚。共表達時ERβ 顯現(xiàn)出抑制由ERα 介導(dǎo)的效應(yīng)，多發(fā)揮與ERα 相反的作用，如抑制脂肪減少、子宮細胞增殖。同型二聚體和異二聚體同時存在時，異二聚體的生物學(xué)作用尚不清楚［6］。膜表面相關(guān)受體的結(jié)構(gòu)和功能尚不清楚，有人認為與ERα 相似。

研究表明，雌激素及其受體在SLE 的病理過程中發(fā)揮著重要作用，而這種作用與受體的類型相關(guān)。動物實驗表明，ERα 基因缺陷的NZM2410 狼瘡傾向雌性小鼠與野生型小鼠相比，有較長的生存率，蛋白尿、腎臟病理分級和血尿素氮水平更低，ERα 基因缺陷的MRL/lpr 的雌性小鼠同樣也有較低的蛋白尿、腎臟病理學(xué)分級，但與體內(nèi)抗體水平?jīng)]有相關(guān)性。而無論是品種和性別，ERβ 基因缺陷對病情沒有影響［7］。Feng 等［8］的兩項動物實驗也表明E2通過ERα 對狼瘡表型的誘導(dǎo)發(fā)揮重要作用。可見，ERα 與SLE 的關(guān)系較為密切。最近有研究者做了敲除ERα 基因的相關(guān)實驗，他們發(fā)現(xiàn)，敲除ERα 基因的狼瘡傾向鼠比未敲除鼠有更低濃度的蛋白尿和更輕微的腎臟疾病，且其存活期更長;敲除ERα 基因的雌性鼠，其B 細胞經(jīng)Toll-樣受體(Toll-like receptor，TLR)激動劑處理后顯著降低了炎癥反應(yīng);敲除ERα 基因的鼠脾細胞比野生型鼠脾細胞干擾素調(diào)節(jié)因子-5(interferon regulatory factor 5，IRF5)(一種狼瘡傾向因子)表達更低［9－10］。

本研究分別采用RT-PCR 法和免疫熒光法檢測PBMCs 中ER 陽性表達細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在基因和蛋白水平上，SLE 患者組和對照組之間ER 表達率均沒有顯著性差異。我們的結(jié)果與Suenaga 等［11］采用Scatchard 分析法的結(jié)果一致，表明ER 亞型在表達率上沒有差異。而Inui 等［12］分離SLE 外周血單個核細胞，采用RQ-PCR 檢測ERα mRNA 和ERβ mRNA 的表達，發(fā)現(xiàn)ERα mRNA 表達水平增加，ERβ mRNA 表達水平降低。說明ER 在表達量上有改變。這種表達量的差異或許與SLE 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，這有待于通過一些深入研究予以證實。Lin等［13］比較分析了20 例女性SLE 患者和6 例女性健康對照的外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocytes，PBLs)中ERα 和T 細胞活化基因——鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在基因和蛋白水平的表達，發(fā)現(xiàn)SLE 患者ERα mRNA 和蛋白顯著增高，經(jīng)雌激素處理后鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶濃度升高，且SLE 患者組比對照組高3.15 倍，證明ERα 過表達后活化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，可能與SLE 的病理過程相關(guān)。因此我們推測某些因素可能通過某種途徑誘導(dǎo)ER mRNA 表達量發(fā)生變化，從而參與SLE 的發(fā)生發(fā)展。

雖然已經(jīng)明確雌激素及受體參與SLE 的病理過程，但其作用機制和發(fā)揮效應(yīng)的途徑并不十分清楚。因此，深入研究SLE 病理狀態(tài)下ER 信號通路和下游信號分子將是探索雌激素對SLE 作用機制的重要途徑。

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