孫建鋼，劉式浩，董宏偉，侯陳寧，謝盈慧，劉子豪，王欣悅，紀(jì)刊，崔妍，李莉

（1. 河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000; 2. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

隨著人類對(duì)紅光的不斷研究，紅光對(duì)機(jī)體的許多作用不斷地被發(fā)現(xiàn)。如紅光可減輕損傷組織中的炎癥反應(yīng)[1]；增強(qiáng)線粒體中多種酶的活性，加速細(xì)胞的新陳代謝，提高機(jī)體免疫力[2]；促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，加速創(chuàng)傷愈合[3]。紅光還可提高血液中血紅蛋白含量，增加紅細(xì)胞數(shù)目，提高血液攜氧能力[4]。因此，紅光被越來(lái)越多地應(yīng)用于祛斑美容、消炎、保健等方面的臨床治療。發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）光源作為一種新型的高效節(jié)能光源已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于攝影、通訊、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域，也正逐步在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。肝臟作為人體的一個(gè)具有生物合成、解毒、分泌膽汁、免疫等重要功能的器官，卻對(duì)缺血、缺氧的耐受性較差，以致?lián)p傷后其功能恢復(fù)較為困難，至今未能發(fā)現(xiàn)有效的治療肝臟損傷的方法。肝臟一旦損傷將會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生較大的影響。本研究通過(guò)應(yīng)用紅色LED光源對(duì)肝損傷大鼠進(jìn)行照射治療，觀察紅光對(duì)肝損傷大鼠肝臟再生功能的影響，為將來(lái)肝臟損傷后的治療探索一種新思路、新方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量230～280 g，由河北醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

氨基甲酸乙酯（上海山浦化工有限公司）；鹽酸利多卡因注射液（1005283，山東華路制藥有限公司）；硫酸慶大霉素（068110305，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司）；10%甲醛溶液（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）。紅色LED光源(河北大學(xué)物理學(xué)院)；采血管（10050，江蘇健康醫(yī)療用品有限公司）。

1.3 動(dòng)物分組

健康雌性SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為空白對(duì)照組、肝損傷模型組、10 min照射組、20 min照射組、30 min照射組。各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.4 建立大鼠肝臟損傷模型

1.4.1 術(shù)前準(zhǔn)備

大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。在術(shù)前1 h給大鼠灌食牛奶（1 mL/100 g），以利于大鼠順利度過(guò)麻醉期，提高大鼠術(shù)后存活率。

1.4.2 麻醉方法

以25%氨基甲酸乙脂2.4 mL/kg（0.6 g/kg）對(duì)大鼠實(shí)施腹腔注射麻醉，該劑量可使大鼠處于四肢無(wú)力的狀態(tài)，如果大鼠反應(yīng)激烈可追加0.05 mL（追加總量不超過(guò)0.1 mL）。

1.4.3 手術(shù)區(qū)備皮

將劍突上1 cm至劍突下3 cm ，腹部正中線右側(cè)2～3 cm 至腹部正中線左側(cè)1 cm區(qū)域，剪毛后用脫毛劑脫毛。應(yīng)用2 %碘伏消毒2次。

1.4.4 局部麻醉

左手輕提右側(cè)肋弓下緣的皮膚，在自腹中線左側(cè)1 cm 至腹中線右側(cè)2 cm皮下注射利多卡因注射液1 mL，進(jìn)行局部麻醉。

1.4.5 模型制備

沿右側(cè)肋弓下緣自腹中線左側(cè)0.5 cm 至腹中線右側(cè)1.5 cm做一長(zhǎng)約2 cm 的腹部斜切口，依次切開皮膚、腹部肌肉和腹膜進(jìn)入腹腔。充分暴露肝臟，離斷鐮狀韌帶，將要結(jié)扎的肝中葉、肝左中葉（即結(jié)扎葉，其余肝葉統(tǒng)稱再生葉）牽托出切口，用準(zhǔn)備好的光面乳膠材料于肝中葉與左中葉分葉的上部進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎力度以結(jié)扎的肝葉剛出現(xiàn)變色為宜，將肝葉還納腹腔復(fù)位，腹腔噴灑硫酸慶大霉素0.03 mL（約0.6萬(wàn)U/kg）。檢查結(jié)扎處無(wú)出血后即可逐層縫合腹壁關(guān)閉腹腔。

1.4.6 術(shù)后護(hù)理

術(shù)后密切觀察大鼠反應(yīng)、活動(dòng)狀態(tài)、飲食飲水及切口愈合情況，術(shù)后每日肌肉注射慶大霉素1.2萬(wàn)U/kg，每日1次，連續(xù)3 d。待大鼠基本恢復(fù)正?；顒?dòng)后，自由飲食飲水。

1.5 照光

將各組SD大鼠置于體積為20 cm×20 cm×20 cm的紙盒中，盒蓋按照光源形狀于正中開口，將紅色LED光源置于開口處進(jìn)行照射。紅光物理參數(shù)：波長(zhǎng)660 nm，半值角20°，功率1 W，光通量70 lm。

空白對(duì)照組，不做任何處理。模型組大鼠進(jìn)行模型復(fù)制后不予LED紅光照射。10 min照射組、20 min照射組、30 min照射組大鼠在進(jìn)行模型復(fù)制后給予LED紅光照射每天2次，連續(xù)照射4周。各照射組每次照射的時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

各組實(shí)驗(yàn)大鼠均于造模4周后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，進(jìn)行血清酶學(xué)檢測(cè)即谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），處死后取肝臟，對(duì)各葉稱重并計(jì)算再生葉占肝總質(zhì)量比例（再生葉質(zhì)量/肝總質(zhì)量），并取再生葉（空白對(duì)照組取同名肝葉）制作切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料均經(jīng)Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，利用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以s表示。

2 結(jié)果

2.1 血清酶學(xué)檢測(cè)結(jié)果

各治療組ALT均低于模型組， 30 min照射組AST低于模型組（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠肝功能比較（ s ，n=10）

表1 各組大鼠肝功能比較（ s ，n=10）

與空白對(duì)照組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 AST ALT空白對(duì)照組 138.00±26.67 24.70±6.51模型組 159.36±23.38 36.90±7.33＃10 min 照射組 146.74±37.97 24.44±2.01*20 min 照射組 146.55±28.53 19.43±5.46*30 min 照射組 110.44±32.87* 19.80±2.98*

2.2 各組再生葉占肝總質(zhì)量比例結(jié)果

各治療組大鼠再生葉占肝總質(zhì)量比例均較模型組增大（P均＜0.05），10 min照射組及20 min照射組再生葉比例均大于空白對(duì)照組（P均＜0.05），見表2。

表2 各組肝臟再生葉占肝總質(zhì)量比例（ s，n=10）

表2 各組肝臟再生葉占肝總質(zhì)量比例（ s，n=10）

與空白對(duì)照組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 再生葉占肝總質(zhì)量比例空白對(duì)照組 65.34±9.89模型組 61.35±17.22 10 min 照射組 77.09±6.50＃*20 min 照射組 77.43±9.15＃*30 min 照射組 73.32±5.53*

2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

光鏡下觀察，空白對(duì)照組肝細(xì)胞無(wú)變性壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝血竇清晰，見圖1A。模型組可見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞輕度再生，部分肝細(xì)胞水腫，見圖1B。10 min照射組、20 min照射組、30 min照射組肝細(xì)胞再生明顯，肝細(xì)胞核明顯增大，可見雙核及核分裂象，未見明顯纖維組織再生，見圖1C、1D、1E。

圖1 各組肝組織形態(tài)學(xué)（HE ×800）

3 討 論

肝臟是成年人體內(nèi)的一個(gè)重要器官，其受損后對(duì)機(jī)體影響較大，故其損傷后良好的再生情況就顯得尤為重要。ALT和AST是評(píng)價(jià)肝功能的靈敏指標(biāo)，該兩項(xiàng)指標(biāo)的升高程度與肝細(xì)胞的受損程度呈正相關(guān)[5]，其中ALT主要分布于肝細(xì)胞胞質(zhì)，肝細(xì)胞輕度受損時(shí)即可釋放入血。而AST主要分布于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，肝細(xì)胞受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)才能釋放入血，故ALT較AST更為敏感。本研究結(jié)果顯示，各照射組ALT均小于模型組，并且已恢復(fù)正常，30 min照射組AST小于模型組，這表明紅光照射治療有助于肝損傷大鼠肝功能的恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，10 min照射組及20 min照射組再生葉比例均大于正常，各治療組再生葉比例均大于模型組，肝臟再生葉組織學(xué)觀察也顯示治療組以及模型組再生葉均有不同程度再生，其中各治療組肝細(xì)胞再生情況較模型組明顯，肝細(xì)胞核明顯增大，可見雙核及核分裂象，表明各治療組肝葉再生能力較模型組明顯增強(qiáng)，甚至超過(guò)了正常大鼠。這一結(jié)果提示紅色LED光源照射對(duì)肝細(xì)胞的再生可能有促進(jìn)作用。

LED光源因具有耗能小、熱輻射低、無(wú)污染、安全、覆蓋光波范圍廣等優(yōu)點(diǎn)已應(yīng)用于許多實(shí)驗(yàn)研究中[6-7]。本研究采用的紅色LED光源能產(chǎn)生600～700 nm波段的高能紅光，對(duì)人體穿透性較強(qiáng)，穿透深度可達(dá)2.5 cm 以上[8]，因此紅光可以直接作用于神經(jīng)、血管等組織發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。

紅光對(duì)于肝損傷大鼠肝臟再生的促進(jìn)機(jī)理尚不清楚。推測(cè)其可能與紅光所具有的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）合成分泌[3]；促進(jìn)人體堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）分泌[3]；促進(jìn)人體VEGF的表達(dá)[9]；增加機(jī)體的血液攜氧能力及血氧飽和度[4]；使急性炎癥反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間明顯縮短，促進(jìn)IGF-1的表達(dá), 提高組織再生速度、愈合質(zhì)量[1]等作用有關(guān)。紅光影響肝臟再生及肝功能恢復(fù)的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究。

[1]王建國(guó), 楊雅麗, 鄭寶森, 等. 紅光照射對(duì)大鼠急性軟組織損傷IGF-1表達(dá)的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2011, 20(7):795-798.

[2]REDDY G K, STEHNO BITTEL L, ENWEMEKA C S. Laser photostimulation accelerates wound healing in diabetic rats[J]. Wound Repair Regen, 2001, 9(3): 248-255.

[3]賈丹兵, 朱宇, 劉珊, 等. 紅光照射對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(13): 1195-1197.

[4]SCHINDL M, KERSCHAN K, SCHINDL A, et a1. Induction of complete wound healing in recalcitrant ulcers by low-intensity laser irradiation depends on ulcer cause and size[J]. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 1999, 15(1): 18-21.

[5]周步高, 喻松仁, 高書亮, 等. 加味茵陳蒿湯對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2012, 23(7):1720-1722.

[6]牛培, 武變瑛, 解志考, 等. 不同LED單色光源照射妊娠母鼠對(duì)其子代學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究與教育, 2012, 29(3):1-4.

[7]李存占, 張智, 段斐, 等. LED藍(lán)光對(duì)大鼠肝再生TNF-I、L-6的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究與教育, 2013, 30(1): 20-22.

[8]李成偉, 張曉媛, 晉志高. 一種紅光治療儀的光譜測(cè)試及機(jī)理探討[J]. 北京生物醫(yī)學(xué)工程, 2006, 25(3): 293-295.

[9]SCHINDL A, MERWALD H, SCHINDL L, et al. Direct stimulatory effect of low-intensity 670nm laser irradiation on human endothelial cell proliferation[J]. Br J Dermatol, 2003, 148(2): 334-336.