王 璇，馬良進(jìn)，呂 全，孟嫻靜，張星耀

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所/國(guó)家林業(yè)局 森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

山核桃Carya cathayensis隸屬于胡桃科Juglandaceae中的山核桃屬Carya，是一種著名的干果樹(shù)種，因其干果富含營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高而得到了廣泛栽培[1]。山核桃干腐病是山核桃生產(chǎn)上一種重要病害，不但影響山核桃的產(chǎn)量，而且會(huì)削弱樹(shù)勢(shì)，嚴(yán)重時(shí)則導(dǎo)致樹(shù)木過(guò)早死亡，并造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。2011年首次報(bào)道山核桃干腐病病原菌為Botryosphaeria dothidea（Moug.ex Fr.）Ces.&De Not，屬于子囊菌門(mén)葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae的葡萄座腔菌屬Botryosphaeria[3]。葡萄座腔菌科真菌是農(nóng)業(yè)和林業(yè)上重要病原菌、內(nèi)生真菌或潛在的致病菌，主要引起樹(shù)木潰瘍病。葡萄座腔菌屬真菌廣泛分布于世界各地，而且寄主范圍廣泛，是森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要真菌類(lèi)群[4]。該菌存在有性型和無(wú)性形階段，其主要形態(tài)分類(lèi)特征為子座、子囊、子囊孢子以及分生孢子的形狀、紋飾、顏色、分隔、長(zhǎng)寬比、大小及壁厚度等[5-6]。另外，培養(yǎng)菌落顏色、氣生菌絲生長(zhǎng)情況及子囊孢子表面超微結(jié)構(gòu)（紋飾）也可用于葡萄座腔菌科真菌的分類(lèi)和鑒定[7]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的基因序列分析方法應(yīng)用于葡萄座腔菌科真菌的分類(lèi)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，如核糖體小亞基基因（SSU），核糖體大亞基基因（LSU），延長(zhǎng)因子α基因（EF1-a），核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS），幾丁質(zhì)合酶基因，β微管蛋白（β-tubulin），A-肌動(dòng)蛋白（A-actin）基因，鈣調(diào)蛋白（calmodulin）基因等基因[8]。尤其rDNA-ITS序列是應(yīng)用最普遍的基因序列，已廣泛地應(yīng)用于很多真菌目、科、屬、種等的分類(lèi)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究采用形態(tài)學(xué)特征與與rDNA ITS相結(jié)合的方法對(duì)分離自中國(guó)山核桃的干腐病菌進(jìn)行了鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和病菌分離

分別從浙江省臨安市的昌化鎮(zhèn)和橫路鎮(zhèn)，淳安縣，桐廬縣和安徽省寧國(guó)市等山核桃產(chǎn)區(qū)采集干腐病標(biāo)本（枝條和樹(shù)干）帶回實(shí)驗(yàn)室，然后在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離與純化培養(yǎng)。具體分離方法：首先選取發(fā)病枝條和樹(shù)干，用乙醇對(duì)病健交接處的組織進(jìn)行表面消毒30 s，然后剪成約5.0mm×5.0mm大小的組織塊，在體積分?jǐn)?shù)為75.0%的乙醇中浸泡5 s，用無(wú)菌水浸洗3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的次氯酸鈉浸泡1 min，最后用無(wú)菌水清洗3次。用滅菌的濾紙吸干水分，將組織塊置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2 d后挑取菌落邊緣的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)、純化，并進(jìn)行編號(hào)和轉(zhuǎn)管保存。

1.2 致病性測(cè)定及病原菌確定

將供試菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上活化培養(yǎng)3～4 d后，用經(jīng)滅菌的直徑為7.0mm的打孔器打取菌餅。室外選取健康的山核桃，采用丁字型接種方法，將菌餅正面朝向傷口，用已浸濕無(wú)菌水脫脂棉保濕。設(shè)置重復(fù)15個(gè)·菌株-1，并設(shè)置空白PDA作為對(duì)照。接種15 d后觀察發(fā)病情況，記錄不同菌株的病斑數(shù)和發(fā)病級(jí)別，并計(jì)算不同菌株的感病指數(shù)。將病斑分為3級(jí)，15 d后病斑大小在10.0mm以上的代表數(shù)值為“3”，10.0mm以下5.0mm以上代表數(shù)值的為“2”，5.0mm以下的代表數(shù)值為“1”，不發(fā)病的代表數(shù)值為 “0”。感病指數(shù)等于各病級(jí)的總代表數(shù)值 （病斑分級(jí)的代表數(shù)值與該級(jí)標(biāo)準(zhǔn)株數(shù)之積）相加，再除以最高一級(jí)的代表數(shù)值與總株數(shù)之積，再乘以100。感病指數(shù)越高表示該菌株的致病性越強(qiáng)。對(duì)發(fā)病病斑進(jìn)行組織分離，分離得到與接種菌株培養(yǎng)特征一致的菌株確定為該病的病原菌。

1.3 病原菌形態(tài)特征觀察

將分離獲得的病原菌菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，觀察菌落培養(yǎng)特性，將菌株接種到由樹(shù)皮煎汁或松針等制成的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)孢子產(chǎn)生。制作徒手切片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察和測(cè)量病原菌分生孢子器、分生孢子梗及分生孢子等特征。根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行病原菌種類(lèi)鑒定。

1.4 病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增與分析

1.4.1 基因組DNA提取 將病原菌轉(zhuǎn)接到PDA平板上，于25℃培養(yǎng)3 d后，刮取約200.0 mg氣生菌絲于滅菌后的1.5 mL的離心管中，-20℃冰凍過(guò)夜，經(jīng)帶研磨杵的電鉆研磨破壁后，采用基因組DNA提取試劑盒（北京寶銳通生物科技有限公司）提取真菌基因組DNA。

1.4.2 rDNA-ITS PCR擴(kuò)增和純化 采用真菌 rDNA-ITS區(qū)域通用引物 ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和 ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。 PCR 反應(yīng)體系總體積為25.0 μL， 包括12.5 μL PCR脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）， 9.5 μL雙蒸水（ddH2O），引物ITS1/ITS4各1.0 μL，模板 DNA 1.0 μL。 反應(yīng)程序：94.0℃預(yù)變性 2 min；94.0℃變性 30 s；57.3℃退火 30 s；72.0℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72.0℃延伸10 min。經(jīng)質(zhì)量濃度為15.0 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將條帶清晰的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交北京寶銳通生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank（http://www.ncbi.nlm.gov）中進(jìn)行同源性比對(duì)，下載參比序列，采用clustalX和Mega 5.0軟件進(jìn)行分析比對(duì)，采用PAUP 4.0和Mrbayes 3.0軟件構(gòu)建最大簡(jiǎn)約法（MP）和貝葉斯法（BI）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 病原菌分離和確定

本研究分離得到129株菌株，選取7株作為實(shí)驗(yàn)菌株，室外接種健康山核桃枝條，保濕培養(yǎng)15 d后，所有實(shí)驗(yàn)菌株均具有致病性，枝條上出現(xiàn)黑色病斑，對(duì)病斑進(jìn)行組織分離得到了相應(yīng)的病原菌。根據(jù)不同菌株枝條發(fā)病數(shù)及其感病級(jí)數(shù)，計(jì)算得到各病原菌的感病指數(shù)。其中CXY1565，CXY1566，CXY1567致病性相近，其病情指數(shù)為77.8，其致病性最強(qiáng)（圖1F），其次為CXY1568和CXY1569，病情指數(shù)為15.6（圖2F），CXY1570和CXY1571菌株致病性最差，其病情指數(shù)為6.7（圖3F）。

圖1 茶藨子葡萄座腔菌Figure1 Botryosphaeria dothidea （CXY1567）

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

以上7株病原菌形態(tài)學(xué)鑒定后共分為3種，一種是Botryosphaeria dothidea（Moug.ex Fr.）Ces.&De Not，以CXY1567為代表菌株，分離頻率為71.4%；另一種是B.fabicercianum sp.Nov.，以CXY1568為代表菌株，分離頻率為14.3%；第3種是B.obtusa De Not.，以CXY1570為代表菌株，分離頻率為14.3%。

Botryosphaeria dothidea：在PDA上25℃菌落生長(zhǎng)速率較快，3～4 d幾乎布滿(mǎn)平板（直徑90.0mm）；初期菌落白色或無(wú)色，氣生菌絲棉絮毛狀，較稀疏；培養(yǎng)1～2 d后，有白色或黃色小點(diǎn)沿菌絲分布，菌落中間有墨綠色色素；隨著色素的沉積，黃色色素逐漸被掩蓋，最后整個(gè)菌落變?yōu)榛液稚缓笃诰溥吘墯馍z倒伏緊貼培養(yǎng)基，菌落背面黃綠色色素呈點(diǎn)狀不均勻分布；隨著色素沉積，整個(gè)培養(yǎng)皿背面逐漸變?yōu)槟G色或黑色。分生孢子器沿菌落邊緣生長(zhǎng)，表生，球形或不規(guī)則形；多腔室，分生孢子梗著生于腔室內(nèi)壁細(xì)胞上，無(wú)色，桿狀。分生孢子無(wú)色，無(wú)隔，錘形，頂部鈍圓，基部比頂部稍尖。大分生孢子 18.0～22.2μm × 4.6～6.9μm，平均為 21.5μm × 5.6μm。 長(zhǎng)/寬比為 3.0～4.0，小分生孢子直徑為4.0～6.0μm（圖 1）。

圖2 Botryosphaeria fabicercianum（CXY1568）Figure2 Botryosphaeria fabicercianum（CXY1568）

圖3 Botryosphaeria obtusa（CXY1570）Figure3 Botryosphaeria obtusa（CXY1570）

Botryosphaeria fabicercianum：在PDA上菌落生長(zhǎng)迅速，5 d可長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿（直徑90.0mm）。菌落初呈白色，菌絲絨毛狀或棉絮狀，4～6 d菌落中央呈煙灰色，邊緣菌絲緊貼培養(yǎng)基；12～16 d氣生菌絲由灰綠色變?yōu)殚蠙炀G色，最后變?yōu)槟G色。分生孢子器表生，散生或聚生，深褐色，球狀，表面有菌絲覆蓋。分生孢子器壁分3層，外層厚，深褐色或淺棕色，角質(zhì)狀；中層細(xì)胞薄壁，淺棕色；內(nèi)層細(xì)胞薄壁，無(wú)色。分生孢子梗缺。產(chǎn)孢細(xì)胞圓柱形或燒瓶形，無(wú)色，光滑，薄壁，頂端產(chǎn)生單個(gè)分生孢子。側(cè)絲無(wú)。分生孢子薄壁，光滑，無(wú)色，單胞，紡錘形，中間至中上1/3處最寬，頂端尖銳，基部平截，邊緣具一個(gè)細(xì)小褶皺。分生孢子萌發(fā)前形成1～2個(gè)隔膜。大分生孢子17.3～24.3μm×4.5～7.5μm，平均為22.7μm × 6.1μm， 長(zhǎng)/寬比為 3.5～4.5， 小分生孢子直徑為 3.8～6.3μm[9]（圖 2）。

Botryosphaeria obtusa：在PDA上25℃生長(zhǎng)迅速，3 d布滿(mǎn)平板（直徑90.0mm），菌落初為白色，氣生菌絲稀疏不發(fā)達(dá)，較短，細(xì)絨毛狀，邊緣整齊；2 d后有墨綠色色素沉積。后期氣生菌絲分布于菌落邊緣，稀疏且長(zhǎng)勢(shì)較弱，中央無(wú)氣生菌絲，或氣生菌絲平鋪。10 d后由于色素沉積，菌落變?yōu)槟谏袝r(shí)具反光；菌落背面由灰黑色變?yōu)槟G色或者黑色。分生孢子器散生，表生，多腔室，腔室圓形或近圓形，無(wú)褶皺，內(nèi)壁上著生分生孢子梗。分生孢子初無(wú)色，單胞，后呈褐色，卵形；大分生孢子為17.3～22.5μm × 8.8～11.3μm， 平均為 21.9μm ×10.2μm， 長(zhǎng)/寬比為 1.8～2.3， 小分生孢子直徑 3.0～4.0μm[10]（圖 3）。

2.3 rDNA-ITS序列分析

通過(guò)對(duì)供試7個(gè)菌株的rDNA-ITS序列測(cè)定和在GenBank中進(jìn)行BLAST搜索和比對(duì)，結(jié)果表明：這些菌株均為葡萄座腔菌科真菌，分別為Botryosphaeria dothidea，B.fabicercianum和B.obtusa菌株（表1）。

表1 供試菌株rDNA-ITS序列與GenBank相關(guān)菌株的相似率Table1 Similarity of rDNA-ITS sequences of the tested fungal strains with related strains blasted in GenBank

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)同源性比對(duì)的結(jié)果，從GenBank中下載33個(gè)與供試菌株關(guān)系相近的ITS序列和1個(gè)Guignardia philoprina（球痤菌屬）序列作為外群，將所有序列整理后進(jìn)行比對(duì)分析。用PAUP 4.0b10對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行最大簡(jiǎn)約法分析，將所有的614個(gè)特征視為無(wú)序且權(quán)重相同，其中120個(gè)恒量特征，和63個(gè)無(wú)效的變量特征Bootstrap法重復(fù)1000次評(píng)估得到各節(jié)點(diǎn)支持率（BS）。利用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建合議樹(shù)步長(zhǎng)（tree length）為 327，一致性指數(shù)（consistency index,CI）0.8，保留指數(shù)（retention index,RI）0.9，趨同性指數(shù)（homoplasy index,HI）0.2， 可調(diào)一致性指數(shù)（rescaled consistency index,RC）0.7； 利用 MrModeltese 3.7分析后，在AIC（Akaike Information Criterion）標(biāo)準(zhǔn)下，獲得最佳模型TIM+G。貝葉斯方法采用馬氏鏈蒙特卡羅（MCMC）算法，共運(yùn)行500萬(wàn)代，所得9902個(gè)樹(shù)的合議樹(shù)中各支的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)與簡(jiǎn)約法基本一致，后驗(yàn)概率（PP）為節(jié)點(diǎn)支持率為PP。最后節(jié)點(diǎn)支持率為BS/PP（圖4）。

基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果將供試7個(gè)菌株與相關(guān)葡萄座腔菌科真菌分為2個(gè)大的類(lèi)群，其中第1個(gè)類(lèi)群包括分支Ⅰ，分支Ⅱ，分支Ⅲ，第2個(gè)類(lèi)群包括分支Ⅳ和分支Ⅴ。

分支Ⅰ包括無(wú)性型為Spencermartinsia viticola等2個(gè)菌株，系加利福尼亞柑橘枝干潰瘍病病菌[11]。供試菌株CXY1570和CXY1571位于分支Ⅱ中，其無(wú)性型為Diplodia。這2個(gè)菌株與B.obtusa菌株聚集在同一分支，與CBS119049的菌株的最大相似率為99%。分支Ⅴ為無(wú)性型Fusicuccom類(lèi)群的菌株，包括Botryosphaeria dothidea，B.fabicercianum和B.cortici。最大簡(jiǎn)約法和貝葉斯法的分析結(jié)果均表明，中國(guó)山核桃干腐病菌包括Botryosphaeria dothidea，B.fabicercianum和B.obtusa。分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

圖4 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure4 The dendrogram constructed based on rDNA-ITS sequences

3 結(jié)論與討論

本研究從山核桃干腐病發(fā)病組織上分離得到了3種葡萄座腔菌屬真菌，其中優(yōu)勢(shì)菌株為Botryosphaeria dothidea，而且致病性最強(qiáng)；而B(niǎo).fabicercianum和B.obtusa分離頻率較低，致病性較弱。

Botryosphaeria是重要的子囊菌，其無(wú)性型包括Diplodia，Dothiorella，F(xiàn)usicoccum，Lasiodiplodia，Sphaeropsis等[12]，是形態(tài)分類(lèi)中最困難的真菌類(lèi)群之一。關(guān)于山核桃干腐病的研究報(bào)道較少，而且關(guān)于病原菌種類(lèi)不明確。楊淑貞等[13]提出該病病原真菌的有性態(tài)為B.fusisporae，無(wú)性態(tài)為Macrophoma caryae。也有研究認(rèn)為山核桃潰瘍病病原屬于半知菌亞門(mén)腔胞綱球殼孢科小穴殼菌Dothiorella gregaria，并指出該病的病原與楊樹(shù)潰瘍病和桃樹(shù)潰瘍病的病原相同[14]。張傳清等[15]認(rèn)為山核桃干腐病菌為B.dothidea。田甜等[16]也認(rèn)為山核桃干腐病病原菌是B.dothidea。本研究結(jié)果認(rèn)為山核桃干腐病菌包括B.dothidea，B.fabicercianum及B.obtusa，但以B.dothidea為優(yōu)勢(shì)病菌。

Botryosphaeria是常見(jiàn)的林木干腐和枯梢病菌，尤其B.dothidea是發(fā)生最普遍和危害最重的病原菌[17]。Smith等[18]報(bào)道，B.dothidea在南非引起桉樹(shù)潰瘍病。另外，該菌是桉屬Eucalyptus和松屬Pinus植物上的內(nèi)生真菌[19]。由于Botryosphaeria屬真菌在自然條件以無(wú)性型最為常見(jiàn)，而且形態(tài)特征有限，所以，僅依靠形態(tài)特征難于進(jìn)行種類(lèi)鑒定。另外，該屬真菌在人工培養(yǎng)條件下很難產(chǎn)生分生孢子器，而且耗時(shí)長(zhǎng)。采用分子生物學(xué)技術(shù)不失為一種有效方法[20]。

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