彭珠清，范輝華，劉 寶，劉 燕，李 靜

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建林業(yè)科學(xué)研究院，福建 福州 350012）

無(wú)患子Sapindus mukurossi屬于無(wú)患子科Sapindaceae無(wú)患子屬Sapindus，是一種非常有潛力的經(jīng)濟(jì)樹種，其果可以用來(lái)制作洗滌劑，種仁能提取生物柴油，樹形美觀，可用于園林觀賞等。日本、法國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣等對(duì)其蘊(yùn)含的經(jīng)濟(jì)價(jià)值有一定的開發(fā)利用，而中國(guó)大陸雖早在幾百年前就已對(duì)其有初步利用，但深度開發(fā)這方面卻尚在起步階段[1-3]。目前，對(duì)無(wú)患子的研究主要集中在生物學(xué)特性、繁殖技術(shù)[1,4]、化學(xué)成分和分離提取技術(shù)及其利用價(jià)值的開發(fā)研究[5－7]等方面，而在分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道不多[8-9]。分子標(biāo)記技術(shù)是研究種質(zhì)資源遺傳背景的重要手段，2001年美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros博士提出了一種新型的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的標(biāo)記方法的相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related ampli-fied polymorphism，SRAP）標(biāo)記方法[8，10]。該標(biāo)記通過(guò)獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因 的 ORFs（open reading frames）的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。與其他分子標(biāo)記相比，該方法具有簡(jiǎn)單高效、多態(tài)性高、重復(fù)性較好等特點(diǎn)，并已成功應(yīng)用于多種蔬菜、經(jīng)濟(jì)樹種的種質(zhì)資源分析中[5-7,11-13]。但在無(wú)患子的遺傳多樣性以及種質(zhì)鑒定等方面還鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以無(wú)患子葉片為材料，采用單因素優(yōu)化的方法建立無(wú)患子SRAPPCR的最佳反應(yīng)體系，旨在為不同地理種源無(wú)患子的遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳改良等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

試驗(yàn)材料采于福建順昌無(wú)患子種源收集區(qū)，共12個(gè)種源地36份種質(zhì)材料。本優(yōu)化試驗(yàn)以福建南平種源地的基因組DNA為試驗(yàn)材料。

1.2 主要試劑

試驗(yàn)中所用的三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTP）s，TaqDNA酶，瓊脂糖和DNA標(biāo)記物均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，其中100 bp標(biāo)記物是加DNA梯度。所用的SRAP引物序列由上海生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列參照 Li等[10]和 Ren 等[14]的方法。

優(yōu)化試驗(yàn)引物選用me2-em7組合，體系驗(yàn)證引物選用me2-em7和me6-em1，序列具體如表1。

1.3 無(wú)患子總DNA的提取

無(wú)患子總DNA提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[15-16]。DNA 的濃度和純度，分別用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分析檢測(cè)。樣品稀釋至 10 μg·L－1后，置－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 反應(yīng)體系的優(yōu)化

SRAP-PCR基本反應(yīng)體系：在20.0 μL總體積中，含 2.0 μL 10×PCR 緩沖液（free Mg2+），2.0 mmol·L－1鎂離子（Mg2+），0.2 mmol·L－1dNTPs，2.0×16.67 nkat（2.0 U） TaqDNA 聚合酶，正反引物各 0.5 μmol·L－1，用雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。

SRAP-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性l min，35℃復(fù)性l min，72℃延伸l min；共5個(gè)循環(huán)。隨后94℃變性l min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸l min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR儀為ABI梯度PCR儀。

本試驗(yàn)采用單因素法對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，分別調(diào)整模板DNA，鎂離子，dNTPs，引物，TaqDNA聚合酶各因子的用量（表2）。

表2 反應(yīng)體系各因子水平Table2 Reaction system in each factor level

1.5 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液（5：1）混合后于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用溴化乙錠（EB）染色后，在凝膠成像系統(tǒng)（AlphaImager HP）上觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)患子基因組DNA檢測(cè)

無(wú)患子葉片內(nèi)富含多酚、多糖、蛋白質(zhì)及其他次生代謝物質(zhì)[14]，操作時(shí)易發(fā)生褐變，干擾DNA的提取，這些物質(zhì)若殘留在DNA樣品中將會(huì)嚴(yán)重影響PCR的效果，導(dǎo)致DNA的酶切、擴(kuò)增失敗，對(duì)后續(xù)試驗(yàn)研究的開展有很大的影響。本研究采用改良的CTAB法，成功提取出質(zhì)量較高的基因組DNA，條帶較為清晰、完整、無(wú)拖尾，符合SRAP分子標(biāo)記對(duì)DNA質(zhì)量的要求（圖1）。

圖1 不同無(wú)患子總DNA電泳檢測(cè)圖Figure1 Electrophoresis of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances

經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，其D260/D280為1.2～2.2（表3），經(jīng)純化均能達(dá)到1.8左右的比值。所有樣品質(zhì)量濃度均大于430 μg·L－1，在SRAP分析中可獲得較為清晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)物。

表3 無(wú)患子總DNA濃度檢測(cè)Table3 Concentration detection of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances

2.2 模板DNA對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

本試驗(yàn)設(shè)定了10個(gè)用量梯度（10～100 ng），研究不同模板DNA用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。模板DNA使用量在設(shè)定范圍內(nèi)，都能擴(kuò)增出幾乎相同的清晰條帶（圖2）。10 ng時(shí)條帶比較模糊；70～100 ng時(shí)，條帶較淡、呈波浪狀，20～60 ng時(shí)主帶比較清晰。DNA較長(zhǎng)時(shí)間保存會(huì)部分降解，致使有效含量降低?？紤]到試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，為避免DNA降解對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，最終選擇50 ng作為模板優(yōu)化用量。

2.3 鎂離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

鎂離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增影響較大。鎂離子濃度過(guò)高時(shí)，TaqDNA聚合酶催化非特異性擴(kuò)增，降低反應(yīng)的忠實(shí)性；反之，鎂離子濃度過(guò)低時(shí)，則又會(huì)使TaqDNA聚合酶的活性下降，反應(yīng)產(chǎn)物減少。當(dāng)鎂離子濃度為 1.00 mmol·L－1時(shí)，未擴(kuò)增出條帶；當(dāng) Mg2+濃度為 1.25～1.75 mmol·L－1時(shí)，條帶模糊，出現(xiàn)缺失現(xiàn)象；當(dāng)鎂離子濃度為2.00～2.50 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增帶型基本一致；當(dāng)鎂離子濃度增至2.75，3.00 mmol·L－1時(shí)，條帶呈彌散趨勢(shì)（圖3）。高濃度鎂離子易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，為避免高濃度鎂離子對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響。本研究最終選擇2.00 mmol·L－1作為鎂離子的優(yōu)化濃度。

圖2 模板DNA用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影Figure2 Effect of DNA template concentration on PCR amplification

圖3 鎂離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure3 Effect of Mg2+concentration on PCR amplification

2.4 dNTPs濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

dNTPs對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)有極其重要的作用，dNTPs濃度過(guò)高會(huì)增加DNA聚合酶的錯(cuò)配率，而濃度過(guò)低又會(huì)降低產(chǎn)量。dNTPs濃度為 0.05～0.15 mmol·L－1時(shí)，條帶較少且模糊，0.20～0.25 mmol·L－1時(shí)條帶較為清晰，在0.30～0.45 mmol·L－1時(shí)條帶又開始模糊，最終確定0.20 mmol·L－1為dNTPs的優(yōu)化濃度（圖 4）。

2.5 TaqDNA聚合酶用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

TaqDNA聚合酶的用量與反應(yīng)體積、酶活性等因素有關(guān)。一般酶用量過(guò)多會(huì)使非特異性增加、彌散背景增強(qiáng)，用量過(guò)少則會(huì)降低產(chǎn)量，使條帶不夠明亮。當(dāng)TaqDNA聚合酶用量為0.5×16.67 nkat（0.5 U）和1.0×16.67 nkat（1.0 U）時(shí)，條帶均較多，但0.5×16.67 nkat（0.5 U）時(shí)，條帶亮度更佳；當(dāng)TaqDNA聚合酶用量（0.6～0.9）×16.67 nkat（0.6～0.9 U）時(shí)，條帶較少；當(dāng) TaqDNA 聚合酶用量為（1.2～2.0）×16.67 nkat（1.2～2.0 U）時(shí)，條帶少（圖 5）。綜上，當(dāng) TaqDNA 聚合酶用量為 0.5×16.67 nkat（0.5 U）時(shí)，擴(kuò)增效果最理想，以此作為TaqDNA聚合酶的優(yōu)化用量。

圖4 dNTPs濃度對(duì)PC R擴(kuò)增的影響Figure4 Effect of dNTPs concentration on PCR amplification

圖5 TaqDNA用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure5 Effect of TaqDNA concentration on PCR amplification

2.6 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生引物二聚體，引物過(guò)低則降低產(chǎn)量。在設(shè)定的引物濃度范圍內(nèi)，PCR產(chǎn)物量基本相同（圖 6）。當(dāng)引物濃度為 0.2～0.4 μmol·L－1有較清晰、 一致的條帶，且 0.4 μmol·L－1時(shí)，條帶較亮；當(dāng)引物濃度為 0.5～1.0 μmol·L－1開始條帶漸變?nèi)?，擴(kuò)增效果不佳，均較模糊。綜上，選擇 0.4 μmol·L－1作為引物的優(yōu)化濃度。

2.7 SRAP-PCR反應(yīng)體系的確立

本研究用引物組合m2e7和m6e1在無(wú)患子材料中進(jìn)行SRAP-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系驗(yàn)證，擴(kuò)增結(jié)果比較穩(wěn)定、條帶清晰（圖7），且引物組合m6e1擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶較引物組合m2e7多，表現(xiàn)出更高的多態(tài)性。由此說(shuō)明，該體系適宜無(wú)患子SRAP-PCR反應(yīng)。

通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的驗(yàn)證，從結(jié)果的穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性出發(fā)，確立了適合無(wú)患子的SRAP-PCR反應(yīng)體系為：在20 μL反應(yīng)體系中，含模板DNA為50 ng，鎂離子 2.0 mmol·L－1，dNTPs 0.2 mmol·L－1，TaqDNA聚合酶 0.5×16.67 nkat（0.5 U）,引物 0.4 μmol·L－1。

圖6 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure6 Effect of primers concentration on PCR amplification

圖7 優(yōu)化體系驗(yàn)證圖（左m2e7，右m6e1）Figure7 Optimized system verification（left m2e7，right m6e1）

3 討論

SRAP標(biāo)記是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①有一套通用引物，可任意搭配，通過(guò)篩選獲取適合引物對(duì)，極大降低了引物合成費(fèi)用。②反應(yīng)條件相對(duì)固定，試驗(yàn)重復(fù)性較好，操作簡(jiǎn)易。因此，在林木種質(zhì)資源遺傳多樣性、品種鑒定等方面應(yīng)用前景廣闊[17-19]。

SRAP-PCR反應(yīng)體系主要包含5個(gè)影響因素，即DNA模板、鎂離子、dNTPs、引物和TaqDNA聚合酶。各個(gè)因素用量不同，將明顯影響擴(kuò)增效果，進(jìn)而影響SRAP分子標(biāo)記的可靠性。高質(zhì)量DNA的獲取是PCR成功的根本性因素，DNA中殘留的蛋白、酚類等物質(zhì)，會(huì)抑制DNA聚合酶。本研究中，采用改良的CTAB法提取了較高質(zhì)量的DNA，符合SRAP-PCR反應(yīng)要求。

PCR混合物中，DNA模板、引物和dNTPs的磷酸堿基均可與鎂離子結(jié)合，降低鎂離子的實(shí)際濃度；而對(duì)TaqDNA聚合酶起作用的是游離的鎂離子，因此，鎂離子加入量應(yīng)高于dNTPs[13]。本試驗(yàn)中，鎂離子濃度比dNTPs高出1.8 mmol·L－1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是由引物限定的，引物濃度過(guò)高，不僅會(huì)促進(jìn)非特異性產(chǎn)物的合成，而且還會(huì)增加引物二聚體的形成，本研究最終選擇0.4 μmol·L－1作為引物的優(yōu)化濃度。

本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的單因素法，確立了適合無(wú)患子的SRAP-PCR反應(yīng)體系。利用該體系對(duì)12個(gè)種源地的無(wú)患子進(jìn)行擴(kuò)增，得到了穩(wěn)定清晰的條帶，效果良好，說(shuō)明優(yōu)化后的體系適宜無(wú)患子種質(zhì)資源的分子標(biāo)記分析，但需對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選。SRAP-PCR優(yōu)化體系的建立，為SRAP分子標(biāo)記在無(wú)患子地理種源多態(tài)性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定等方面打下良好的基礎(chǔ)。

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