武孔煥，聶菊芬，王志蕓，賀能琴

（云南高原湖泊流域污染過程與管理重點實驗室 （籌），云南省環(huán)境科學(xué)研究院，云南昆明650034）

人工濕地中反硝化細菌的篩選及鑒定

武孔煥，聶菊芬，王志蕓，賀能琴

（云南高原湖泊流域污染過程與管理重點實驗室 （籌），云南省環(huán)境科學(xué)研究院，云南昆明650034）

用平板劃線的方法分離和純化濕地中的反硝化細菌，從陶粒、碎石和分子篩中共篩選到19株具有潛在反硝化能力的菌株，根據(jù)生長速度和外觀形態(tài)，將其歸為4類。分離出的菌株中硝氮去除率在50%以上的菌株有15株，其中去除率最高的菌株為FZS1、FZS4和FZS6，分別為99.67%、98.06%和97.26%，都為兼性厭氧、可運動性細菌。

反硝化細菌；篩選；鑒定；人工濕地

氮素是導(dǎo)致水體污染的重要污染物之一，在國內(nèi)外，氮素的治理工作日益受到重視，生物脫氮技術(shù)受到廣大研究者的關(guān)注。生物脫氮技術(shù)是以反硝化細菌為主，在兼性厭氧條件下，把硝酸鹽及亞硝酸鹽作為電子受體而生成氮氣的過程。從環(huán)境中分離、篩選高效反硝化菌株，并掌握其脫氮特性，是提高反硝化細菌應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

陳朋等篩選到一株反硝化細菌LZ－14，通過硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗，證明該反硝化細菌具有良好的產(chǎn)氣能力，可以作為生物脫氮的菌種來源［1］。曾慶武篩選到的反硝化細菌A13經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，該菌株不會嚴重積累亞硝酸鹽，其最適反應(yīng)條件為溫度32.5℃、CODMn35.1mg／L、時間114.2h、投菌量6.2×l06cfu／ml，在最適反應(yīng)條件下，脫氮效率高達99%以上［2］。邵晴等分離篩選到的反硝化細菌A1，其反硝化作用主要集中在菌體的對數(shù)生長期，對亞硝酸鹽的降解率達到99%［3］。

本研究以濕地中的不同基質(zhì) （陶粒、碎石和分子篩）為基礎(chǔ)，采用一定的生物學(xué)手段，嘗試從這些基質(zhì)中分離、篩選出具有高效脫氮功能的菌株。

1 試驗材料與方法

1.1 基質(zhì)采集

采集通?？h六一大溝人工濕地中的基質(zhì) （陶粒和碎石）和昆明理工大學(xué)呈貢校區(qū)的基質(zhì) （分子篩），基質(zhì)置于4℃保存?zhèn)溆?（陶粒簡稱TL、碎石簡稱SS、分子篩簡稱FZS）。

1.2 濕地中反硝化細菌數(shù)量的測定

反硝化過程對NO3－消耗的速率顯著大于基質(zhì)中其它生物化學(xué)過程對的利用，因此通過在適宜的培養(yǎng)條件下，測定介質(zhì)中＋的消失量，可以初步估計反硝化細菌的數(shù)量，采用最大可能數(shù)法［4］。

1.3 濕地中反硝化細菌的篩選

1.3.1 培養(yǎng)基成分［5］

（1）菌株分離、純化、保藏培養(yǎng)基

CH3COONa，2g；蛋白胨，15g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；瓊脂，12g；KNO3，1.5g；pH控制在7.0～7.2。

（2）菌株篩選、脫氮培養(yǎng)基

CH3COONa，2 g；KH2PO4，0.4 g；MgSO4· 7H2O，0.6g；CaCl2·2H2O，0.07g；KNO3，1g；pH控制在7.0～7.2。

（3）需氧性測定培養(yǎng)基

蛋白胨，10g；酵母膏，5g；葡萄糖，lg；瓊脂，15g。

1.3.2 試劑

二苯胺試劑：0.5g無色的二苯胺加入到20ml蒸餾水及100ml濃硫酸中。

1.3.3 菌株分離和純化

基質(zhì)懸液制備［6］：分別稱取10g基質(zhì) （陶粒、碎石和分子篩）至90ml無菌水中，置于搖床上振蕩30min，然后吸取lml基質(zhì)混合液至試管中的無菌水（9ml）中，得到10－2稀釋液，依次按10倍稀釋法稀釋至10－9，由此得到各種水樣的稀釋樣。

分別吸取各稀釋液0.lml至反硝化細菌分離用固體培養(yǎng)基平板 （已放置過夜，無雜菌生長），用涂棒將稀釋液涂布均勻。之后將平板倒置，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

待平板長出菌落后，挑選形態(tài)大小各異的菌落用劃線培養(yǎng)的方式進行分離。記錄所挑取菌落的形態(tài)、大小、邊緣、質(zhì)地、凹凸性、光學(xué)特征、顏色、同心環(huán)和光澤度等。

分離得到的菌株用劃線培養(yǎng)的方式對其純化，在此過程中用顯微鏡觀察，看有無雜菌生長，至無雜菌生長時，方可認為菌株已經(jīng)純化完畢。純化后的菌株接種于斜面培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 反硝化的脫氮能力

于150mm×15mm的試管中加入已滅菌冷卻后的DM培養(yǎng)基，用接種環(huán)挑取純化后的各菌落 （1環(huán)）于試管內(nèi)，震蕩使其混勻。加入滅菌的液體石蠟1ml封口，以未接種任何菌種的試管做空白對照。待所有菌株接種完畢，將其置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

培養(yǎng)9d后，吸取菌液，用0.22μm微孔濾膜過濾，測定濾液中NO3－－N和NO2

－－N含量變化，確定篩選到菌種的反硝化脫氮能力。

1.3.5 需氧性及運動性測定

將需氧性測定培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)并滅菌，滅菌結(jié)束后冷卻。用接種針取少許菌株菌落，對試管底部作垂直穿刺接種。置于冷水中讓其冷卻凝固。于30℃培養(yǎng)7d，觀察細菌沿穿刺線的生長情況。以未接種細菌的試管作空白對照，平行2份。

1.3.6 試驗指標(biāo)檢查方法NO2

－－N用N－（1－萘基）－乙二胺分光光度法，NO3

－－N用紫外分光光度法。

2 試驗結(jié)果和討論

2.1 濕地中反硝化細菌數(shù)量的測定

采用MPN計數(shù)法監(jiān)測了濕地中反硝化細菌的數(shù)量，從表1可知陶粒中的反硝化細菌數(shù)量最多，為20497MPN／g；其次分別為分子篩和碎石。出現(xiàn)這種差異情況可能和各基質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系。陶粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈細密蜂窩狀微孔，這些微孔有益于微生物的生長，而碎石和分子篩的表面較陶粒光滑，不利于微生物的生長，因此微生物數(shù)量少于陶粒的微生物數(shù)量。

表1 各基質(zhì)反硝化細菌數(shù)量

2.2 濕地中反硝化細菌的篩選

以濕地中各種不同的基質(zhì)為基礎(chǔ)，采用直接分離的方式篩選反硝化細菌。具體操作過程為：將各種基質(zhì)用無菌水制成各種稀釋度的懸液，然后采用涂布平板法將各種基質(zhì)懸液均勻涂至固體培養(yǎng)基，并放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

從圖1可以看出，各菌落形態(tài)差異較大，顏色和大小都不同，說明本研究選用的基質(zhì) （陶粒、碎石和分子篩）具有微生物多樣性的特征。細菌菌落主要出現(xiàn)在10－2和10－3稀釋度上，而其它稀釋度菌落生長相對較少。相關(guān)的研究表明，在實驗室條件下，基質(zhì)中絕大部分微生物是不能培養(yǎng)的。因此不同基質(zhì)懸液涂布平板后菌落生長情況并不能準確表明各基質(zhì)中微生物的實際數(shù)量，但可以大致反映微生物種群的多樣性。

表2 不同基質(zhì)分離出的各菌株形態(tài)特征

表3 各菌株培養(yǎng)5d后－N和－N含量變化比較

表3 各菌株培養(yǎng)5d后－N和－N含量變化比較

菌株編號 NO－3－N含量／（mg／L）／%空白對照NO2－－N含量／（mg／L）NO3－－N去除率／% NOx－N去除率244.442 0 TL1 120.652 16.718 50.64 43.80 TL2 115.891 11.326 52.59 47.96 TL3 113.511 0.622 53.56 53.31 TL4 108.129 0.235 55.76 55.67 TL5 149.01 11.326 39.04 34.41 TL6 131.519 11.741 46.20 41.39 SS 1 110.199 0.149 54.92 54.86 SS 2 113.615 0.168 53.52 53.45 SS3 147.457 14.23 39.68 33.85 SS 4 131.312 14.368 46.28 40.40 SS 5 112.683 0.932 53.90 53.52 SS 6 107.094 0.199 56.19 56.10 SS 7 113.097 0.168 53.73 53.66 FZS1 0.805 0.415 99.67 99.50 FZS2 74.39 11.05 69.57 65.05 FZS3 117.651 10.911 51.87 47.40 FZS4 4.738 0.315 98.06 97.93 FZS5 110.82 0.163 54.66 54.60 FZS6 6.704 0.166 97.26 97.19

在實驗過程中，通過肉眼觀察，挑取外觀差異較大的19株菌株，進行純化。將各菌株依次命名為TL1至TL6、SS 1至SS7、FZS1至FZS6，本研究按菌株的生長速度，大致將其分為四類：

A類：TL2、TL5、SS1、SS4、SS5、SS7號共6支菌株，長勢旺盛、迅速，培養(yǎng)24h即能長出顯著菌落；

B類：TL1、TL3、TL4、TL6、SS2、SS3、SS6、FZS1、FZS 2、FZS3、FZS5號共11支菌株，長勢較為緩慢，經(jīng)過4d的培養(yǎng)后長出菌落，可菌落大小明顯小于A類菌落，菌落呈點狀；

C類：FZS 4菌株，生長旺盛、迅速，培養(yǎng)24h就可見菌落已鋪滿大半個平板；

D類：FZS 6菌株，生長旺盛、迅速，培養(yǎng)24h就可見菌落已鋪滿整個平板。

為了驗證持續(xù)培養(yǎng)是否影響各菌株的形態(tài)特征，對純化之后的菌株繼續(xù)培養(yǎng)7d，發(fā)現(xiàn)各菌株的菌落形態(tài)和以上描述的大致相似。

篩選到的19株反硝化細菌都為單個排列方式的桿狀細菌，形狀上表現(xiàn)為點狀、圓形、絲狀等，表面光滑、濕潤和邊緣整齊的菌株有15株，不透明和有光澤的菌株占大部分，顏色上表現(xiàn)各異，包括乳白色、白色、棕色，黃色等（表2）。

從表3可看出，各菌株培養(yǎng)9d后，各管中NO3

－－N的含量都表現(xiàn)出不同程度的下降，表明本研究分離出的菌株都具有一定的硝酸鹽還原能力。測定結(jié)果表明NO3－－N含量去除率在50%以上的菌株有15株，其中去除率最高的菌株為FZS1、FZS4和FZS6，分別為99.67%、98.06%和97.26%。在硝酸鹽含量降低的過程中，各管中都出現(xiàn)亞硝酸鹽累積的現(xiàn)象，最高累積硝酸鹽的菌株為TL1菌株（16.718 mg／L）、SS4菌株（14.368 mg／L）和SS3菌株（14.23 mg／L）。NO3－－N含量的降低，表明篩選到的菌株具有還原硝酸鹽的能力，但是NO2－－N累積的現(xiàn)象，又說明某些菌株只具有將NO3－－N初步還原為NO2

－－N的能力，但無法進行或尚未進行進一步的還原反應(yīng)，導(dǎo)致不能從反應(yīng)體系中徹底脫氮［1］。

從本研究的結(jié)果可知，F(xiàn)ZS1、FZS4和FZS6同時具有較高的硝酸鹽還原能力和亞硝酸鹽還原能力，表明它們對－－N的去除建立在－N轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，應(yīng)是具有完整的反硝化酶系，從而表現(xiàn)出較強的脫氮能力［1］。這些菌株可以用于后續(xù)試驗，確定菌株的最適溫度、碳氮比、碳源、pH等，為后續(xù)用于實際生產(chǎn)提供理論參考。

在培養(yǎng)基的表面和整個穿刺線都能觀察到細菌的生長 （圖2），表明篩選的菌株都為兼性厭氧菌；同時可見細菌的穿刺線較粗，表明細菌具有運動性，屬于可運動性細菌。

［1］陳朋.反硝化細菌的篩選、鑒定及其強化處理硝酸鹽廢水的研究［D］.濟南：山東大學(xué)，2009.

［2］曾慶武.反硝化細菌的分離篩選及應(yīng)用研究 ［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［3］邵晴，余曉斌.好氧反硝化細菌的篩選及反硝化特性研究［J］.生物技術(shù)，2008，18（3）：63－65.

［4］許光輝，鄭洪元.土壤微生物分析方法手冊 ［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986：110－118，234－241.

［5］Shi HR，Lee CM.Combining anoxic denitrifying ability with aerobic－anoxic Phosphorus－rernoval examinations to serene denitrifying phosphorus－removing bacteria［J］.Intemational Biodeterioration＆Biodegradation，2006，57（2）：121－128.

［6］中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法［M］.北京：科學(xué)出版社，1985：5.

Isolation and Identification of Denitrifying Bacteria in Constructed W etland

WU Kong－h(huán)uan，NIE Ju－fen，WANG Zhi－yun，HE Neng－qin
（Yunnan Institute of Environmental Science，Yunnan Key Laboratory of Pollution Process and Management of Plateau Lake－watershed（Prepare to Construct），Kunming Yunnan 650034 China）

Streak platemethod was applied to isolate and purify the denitrification bacteria from wetland.Nineteen bacterial strains having the potential denitrification capacity were selected from ceramic，stone，and molecular sieves.These strains were categorized into 4 groups based on their growth speeds and appearances.The results showed that fifteen bacterial strains could remove more than 50 percent of nitrate nitrogen.Among the bacterial strains，three groups of strains，namely FZS1，F(xiàn)ZS4，and FZS6，have the highest removal rates of 99.67%，98.06%，and 97.26%respectively.All these bacterial strains are facultative anaerobic and motile.

denitrifying bacteria；select；identify；constructed wetland

X52

A

1673－9655（2014）06－0006－04

2014－05－28