熊 飛 周 亮 余徐潤 王 忠

(揚州大學生物科學與技術學院，揚州 225009)

小麥是世界上種植面積最大、貿(mào)易量最大的糧食作物，我國小麥種植面積僅次于水稻，約占糧食作物種植面積的27%［1］。小麥胚乳在發(fā)育過程中合成大量的貯藏蛋白既是早期種子萌發(fā)的重要能量來源，也是人類植物蛋白的重要來源［2－3］。胚乳蛋白質由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組成，其中前兩者為代謝蛋白，約占籽粒蛋白質總量的20%，決定小麥的營養(yǎng)品質，后兩者為種子貯藏蛋白，約占籽粒蛋白質總量的80%左右，決定小麥的加工品質［4－5］。

小麥胚乳蛋白體是積累蛋白質的細胞器，蛋白體發(fā)育的好壞直接影響小麥的產(chǎn)量和品質［6］。有研究表明［7－8］，小麥胚乳細胞中的蛋白體約在花后第8～9天出現(xiàn)。小麥蛋白體出現(xiàn)的時間與品種特性和氣溫有關，蛋白體隨胚乳細胞充實而增大，多個小蛋白體相互融合形成大的蛋白體。

關于小麥貯藏蛋白體的形成有2種不同的觀點，即通過高爾基體形成蛋白體［9－10］還是通過內(nèi)質網(wǎng)衍生出蛋白體［8］。許多研究表明［11－15］，在小麥胚乳發(fā)育及養(yǎng)分輸入時，蛋白質在粗內(nèi)質網(wǎng)上合成，濃縮于高爾基體中，由高爾基體產(chǎn)生的富含蛋白質的高爾基體小泡從高爾基體上脫落下來，在細胞質中相互融合或被液泡胞溶成為蛋白體［6］。Parker［16］認為當?shù)鞍左w出現(xiàn)時高爾基體就開始分泌電子不透明小泡。Kim等［9］通過麥醇溶蛋白的定位表明，高爾基體參與了小麥蛋白體的形成，高爾基體分泌的電子濃密小泡含有麥醇溶蛋白，這些濃密小泡與大的電子透明小泡或液泡相連，有些濃密小泡在細胞質中相互融合形成大的蛋白顆粒，然后進入蛋白質貯藏液泡。

前人的研究大多集中在對單個小麥品種胚乳蛋白體發(fā)生及發(fā)育的研究［6，8－10］，而且對蛋白質積累的研究大多是基于籽粒干物質積累和轉運、籽粒成分和相關酶活性等指標分析上［2，4］，而從微觀結構對不同專用小麥胚乳不同部位的蛋白質積累的研究較少。本研究以不同面筋強度的小麥為試驗材料，對品種間及胚乳腹部和背部蛋白體積累的差異進行了比較研究，旨在為我國小麥品種的品質改良和加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高筋小麥徐麥30、中筋小麥揚麥11、低筋小麥揚麥13:國家小麥改良中心揚州分中心。

1.2 試驗設計

試驗于2011～2012年在揚州大學江蘇省作物栽培生理重點實驗室試驗場進行，條播，隨機區(qū)組排列，重復3次。

1.3 穎花標記

在開花期用記號筆點穎和植株掛牌相結合的方法正確標記穎花的開花時間，標記的穎花均為穗中部小穗基部的2朵花，在盛花期同一天掛牌標記開花時間。

1.4 樹脂切片樣品的制備

于花后8、11、14、17 d采集大小一致的穎果，取中部2 mm橫斷置于2.5%GAL(戊二醛)前固定3 h，再經(jīng)乙醇系列脫水，環(huán)氧丙烷置換，用低黏性的Spurr樹脂浸透與包埋。用Leica超薄切片機切取1 μm厚的半薄切片。

1.5 半薄切片與光鏡染色觀察

用1% 甲苯胺藍(TBO)染色5 min，在 Leica DMLS光學顯微鏡下觀察并拍照，拍攝的照片放大倍率均為200倍。

1.6 掃描電鏡樣品制備與觀察

選取成熟干燥的飽滿籽粒，用鑷子夾住兩端，使其自然斷裂，選取斷面完整且平整的材料，用雙面膠帶將樣品粘在樣品臺上(使籽粒的斷裂面大致在同一水平面上)，離子濺射鍍金后于揚州大學測試中心環(huán)境掃描電子顯微鏡(PhilipsXL－30 ESEM)下觀察并拍照。

1.7 蛋白體的參數(shù)測量

選取有代表性的小麥穎果4個，每個穎果腹部和背部(圖1)選取了10張光學顯微鏡拍攝的照片，從光學顯微鏡拍攝的照片上選取40個胚乳細胞，采用Image－Pro Plus軟件測量穎果斷面蛋白體的面積并進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行顯著性檢驗和方差分析。

圖1 小麥穎果胚乳腹部和背部

2 結果與分析

2.1 高、中、低筋小麥腹部胚乳細胞蛋白體積累的差異

花后8 d高、中、低筋小麥腹部胚乳細胞中開始積累小蛋白體，較分散的分布在胚乳細胞中(圖2a1，圖2b1，圖2c1)，但不同品種間蛋白體面積及數(shù)目無顯著差異(圖3)?；ê?1 d胚乳細胞中蛋白體增多，其中高筋小麥胚乳細胞中小蛋白體互相融合形成大蛋白體，細胞內(nèi)蛋白體面積徐麥30＞揚麥11＞揚麥13(圖2a2，圖2b2，圖2c2)?；ê?4 d胚乳細胞內(nèi)小蛋白體大量增加同時其融合形成的大蛋白聚集體增多，面積徐麥30＞揚麥11＞揚麥13(圖2a3，圖2b3，圖2c3)。花后17 d胚乳細胞內(nèi)蛋白體積累值達到高峰，隨著胚乳淀粉粒的逐漸增多，蛋白體被擠壓到淀粉粒間隙中，蛋白體大小和數(shù)目顯著增加，但不同品種間差異不顯著(圖2a4，圖2b4，圖2c4)。

圖2 小麥穎果腹部胚乳細胞蛋白體的發(fā)育

從胚乳細胞內(nèi)蛋白體的面積變化可知(圖3)，花后8～17 d，高、中、低筋小麥腹部胚乳細胞蛋白體面積呈現(xiàn)先慢后快的積累變化，其中8、11、14 d蛋白體面積品種間差異顯著，表現(xiàn)為徐麥30＞揚麥11＞揚麥13，而花后17 d蛋白體面積值無顯著差異。這說明不同品種小麥蛋白體的積累量的差異主要表現(xiàn)在發(fā)育早期即灌漿高峰期，后期差異小。

圖3 小麥穎果腹部蛋白體面積的變化

2.2 高、中、低筋小麥背部蛋白體積累的差異

由圖4可知，花后8 d高、中、低筋小麥背部胚乳細胞內(nèi)蛋白體較少，呈零星分布，品種間細胞斷面內(nèi)蛋白體總面積也無顯著差異(圖4a1，圖4b1，圖4c1，圖5)。花后11 d背部胚乳細胞內(nèi)蛋白體增多，其中徐麥30、揚麥11蛋白體積累量高于揚麥13(圖4a2，圖4b2，圖4c2)。花后14 d蛋白體積累量顯著增加，徐麥30胚乳細胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的蛋白聚集體，同時其蛋白體面積高于揚麥11和揚麥13，差異顯著(圖4a3，圖4b3，圖4c3)?；ê?7 d，蛋白體積累達到高峰，胚乳細胞內(nèi)出現(xiàn)了許多大蛋白體和蛋白聚集體(圖4a4，圖4b4，圖4c4)，受淀粉粒積累的影響，徐麥30胚乳細胞內(nèi)蛋白體被擠壓出現(xiàn)一定程度的變形，而蛋白體大小品種間表現(xiàn)為徐麥30＞揚麥11＞揚麥13。

圖4 小麥穎果背部胚乳細胞蛋白體的發(fā)育

從蛋白體面積變化趨勢可知(圖5)，花后8、11、14、17 d不同品種間蛋白體積累總量徐麥30＞揚麥11 ＞ 揚麥13，差異主要表現(xiàn)在11、14、17 d，其中11 ～17 d為背部胚乳細胞蛋白體的快速積累期。

圖5 小麥穎果背部蛋白體面積的變化

2.3 小麥穎果腹部和背部蛋白體積累的差異

圖2和圖4顯示高、中、低筋力小麥胚乳腹部和背部蛋白體積累的差異。以中筋力揚麥11為例，花后8 d背部胚乳細胞中蛋白體較少，而腹部胚乳細胞中已經(jīng)積累了較多的蛋白體(圖2b1，圖4b1)?；ê?1 d背、腹部胚乳細胞中蛋白體顯著增加，腹部胚乳細胞中出現(xiàn)了較多的蛋白聚集體，蛋白體面積腹部高于背部，差異顯著(圖2b2，圖4b2)。花后14 d腹部胚乳細胞中出現(xiàn)了較多的大蛋白體和蛋白聚集體，而背部胚乳細胞中較少(圖2b3，圖4b3)。花后17 d隨著胚乳細胞的逐漸充實，背部、腹部胚乳細胞中均出現(xiàn)了較多的大蛋白體，腹部較多，而蛋白體面積腹部顯著高于背部(圖2b4，圖4b4)。

由圖6可知，8～14 d為蛋白體的緩慢增長期，蛋白體面積腹部高于背部。14～17 d為蛋白體的快速增長期，蛋白體面積差異較大，腹部顯著高于背部。以上數(shù)據(jù)綜合表明，對于中筋小麥揚麥11而言，穎果腹部胚乳細胞蛋白體積累量高于背部，蛋白體積累速率經(jīng)歷了從慢到快的積累過程。

圖6 揚麥11穎果背、腹部蛋白質面積的變化

2.4 小麥成熟籽粒蛋白體分布的差異

圖7為高、中、低筋小麥成熟籽粒斷面掃描電鏡圖。從圖7可知，成熟籽粒胚乳細胞中淀粉粒含有大小淀粉2種形態(tài)，大淀粉粒呈橢圓形或餅形，小淀粉粒呈圓球形。不同品種間以強筋小麥蛋白體基質分布稍多，充實在淀粉體間隙(圖7a)，被擠壓程度較高，而低筋小麥蛋白體基質較少，其淀粉體之間還存在較多空隙(圖7c)，中筋小麥蛋白體分布形態(tài)介于兩者之間，差異不大(圖7b)。

圖7 小麥成熟籽粒蛋白體和淀粉粒的分布

3 討論

本試驗結果顯示，在小麥穎果發(fā)育過程中，高筋小麥腹部和背部胚乳細胞中蛋白體面積最高，中筋小麥次之，低筋小麥最低。這從微觀結構角度進一步驗證了不同面筋強度的小麥蛋白質積累的差異［2］?；ê? d胚乳細胞開始積累蛋白體，但品種間無顯著差異，而到花后11、14 d時差異達到顯著，高筋小麥胚乳細胞中蛋白體面積保持快速增長的趨勢，中筋和低筋次之，而到17 d蛋白體面積值無顯著差異。小麥胚乳細胞中積累的貯藏蛋白質主要是麥醇溶蛋白和谷蛋白［17］。醇溶蛋白基因位點是一個復合位點，每個位點都編碼數(shù)個甚至十多個等位亞基，編碼醇溶蛋白的基因位于第1、6部分同源染色體短臂上的 Gli－1、Gli－2 位點上［18］，麥谷蛋白分為高分子質量麥谷蛋白亞基(HMW－GS)和低分子質量麥谷蛋白亞基(LMW－GS)，前者由位于第一同源組群染色體長臂的Glu－A1、Glu－B1和Glu－D1位點的基因編碼，而后者由位于短臂上的Glu－A3、Glu－B3和 Glu － D3 位點的基因編碼［19－20］。從分子角度上分析，我們推測不同專用小麥貯藏蛋白質含量的差異與這些基因表達量有關。

本試驗結果表明，胚乳不同部位積累蛋白體的數(shù)量和大小不同，一般認為，亞糊粉層蛋白體積累早且數(shù)目多，而胚乳中部蛋白體分布較少［21］。本研究將胚乳不同部位劃分成背部和腹部(圖1)，發(fā)現(xiàn)胚乳細胞中蛋白體面積腹部高于背部，而且腹部胚乳細胞中含有較多的大蛋白體，推測這種差異的形成可能與不同部位胚乳細胞發(fā)育及灌漿物質的輸入途徑差異有關。王忠等［6］認為，來自篩管的灌漿物質經(jīng)珠心突起卸載至灌漿“池”，而后由2條途徑進入胚乳，一條是經(jīng)灌漿“池”邊的傳遞細胞進入胚乳，一條通過胚乳外圍的糊粉層細胞進入胚乳。小麥穎果腹部離“灌漿池”近，糊粉層細胞集中，所以氮基酸等灌漿物質充足，因此合成的蛋白體多而大，而背部糊粉層離“灌漿池”遠，氨基酸等灌漿物質運輸距離遠，因此背部胚乳灌漿物質少，蛋白體積累少，面積小。

本試驗選用胚乳發(fā)育時期為花后8～17 d，此時期為籽粒灌漿的高峰期。由于此時期蛋白體在胚乳細胞中積累較少，受淀粉粒積累影響程度較低，從微觀結構上容易觀察蛋白體的發(fā)育及積累過程，因此，本研究所選時期可真實反映胚乳細胞蛋白體發(fā)育及積累的動態(tài)規(guī)律。而在穎果發(fā)育后期，由于淀粉粒的大量積累，將蛋白體擠壓在淀粉?？障吨g，蛋白體的大小及面積都會發(fā)生變形，因此從微觀上觀察蛋白體的發(fā)育過程以及用Image－Pro Plus軟件測量蛋白體的面積已不再適宜。

4 結論

不同筋力小麥腹部和背部蛋白體發(fā)育存在明顯差異。品種間在腹部和背部蛋白體積累量表現(xiàn)為徐麥30＞揚麥11＞揚麥13，尤以花后11、14 d突出;同一品種胚乳腹部和背部蛋白體積累量表現(xiàn)為腹部＞背部，且差異顯著。

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