武 肖 傅玉穎 潘偉春 關(guān)鵬翔 盧錦麗

(浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310035)

各種來源的球蛋白因其良好的營養(yǎng)價值和對食品質(zhì)構(gòu)的影響在食品工業(yè)中具有重要的作用［1］。這種質(zhì)構(gòu)特性由蛋白質(zhì)交聯(lián)形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)決定，所以凝膠作為球蛋白的一種非常重要的功能特性常用來改善食品質(zhì)構(gòu)［2］。蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到多種外部因素影響。理論上，pH、離子強度、加熱溫度和加熱速率是影響球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要因素［3－5］;現(xiàn)實中，他們也是食品工業(yè)中用來調(diào)控蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)的常用加工參數(shù)。

小變形振蕩(動態(tài))流變測試是評價蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的一種非常有效的方法，它對樣品物理結(jié)構(gòu)和化學組成的改變極其敏感，非常適合考查凝膠形成過程中的一些微小變化［6－7］。高儲能模量表示分子間有更多的相互作用和很強的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而低的tanδ表示更好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［8］。

目前，大量研究集中于pH、離子強度和溫度對蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)的影響，而加熱和冷卻速率對蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響的報道較少，特別是冷卻階段對蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)和性質(zhì)具有很大的影響。Sun等［9］發(fā)現(xiàn)慢的加熱速率對豌豆球蛋白凝膠有不利的影響，而較慢的冷卻速率能夠增加蛋白質(zhì)凝膠的強度。本試驗意在探討加熱和冷卻速率對大豆蛋白熱誘導凝膠特性的影響，以期為大豆蛋白的開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕:山東萬得福集團實業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安東帕MCR 302流變儀:奧地利安東帕(中國)有限公司;高速冷凍離心機(H1850R型):湖南湘儀離心機儀器有限公司;pH計(PHS－3C型):上海理達儀器廠;冷凍干燥機(FD－1C－50型):北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;半微量凱氏定氮儀(KJ2300型):福斯中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

采用堿溶酸沉法制備大豆分離蛋白(SPI)，將低溫脫脂豆粕按1∶15的比例與去離子水混合，室溫攪拌2 h后9 710 r/min離心30 min，取上清液用1 mol/L HCl調(diào)pH至4.5(等電點)，4℃下靜置2 h后8 690 r/min離心10 min，取蛋白凝乳重新溶于去離子水中，1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，然后以9 710 r/min下離心30 min除去少量不溶物，透析48 h后冷凍干燥。測其蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為92.5%(N×6.25)。

1.3.2 流變分析

將SPI溶于去離子水中配成12%的溶液，充分溶解后，使用流變儀進行動態(tài)振蕩分析，所用轉(zhuǎn)子為同軸圓筒雙間隙(型號:DG26.7)，約5 mL樣品倒入圓筒中，待轉(zhuǎn)子到達測量部位時，在樣品表面滴加少許硅油以防水分揮發(fā)。

分析測試程序:樣品在25℃下平衡2 min，溫度范圍25℃～95℃～25℃(從室溫到95℃，足夠使大豆蛋白變性且常用于食品工業(yè)中)，加熱和冷卻速率分別為 4、2、1、0.5 ℃ /min，應(yīng)變?yōu)?1%，頻率 1 Hz。隨后對樣品進行頻率掃描:25℃下0.01～10 Hz。收集每個樣品儲能模量(G')、耗能模量(G″)和 tanδ(G″/G')，取1 Hz時數(shù)據(jù)比較形成凝膠的特性。所設(shè)應(yīng)變值在熱誘導蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的線性黏彈區(qū)內(nèi)(預(yù)試驗所得)。每個樣品測3次。

凝膠點是凝膠開始形成時的溫度，本試驗采用加熱階段G'快速增加時G'與G″交點的溫度作為大豆蛋白的凝膠點。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均進行3次重復(fù)試驗，采用SPSS軟件進行分析，測定結(jié)果以均值±標準差表示。試驗數(shù)據(jù)采用ANOVA和Duncan分析(95%置信區(qū)間)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆蛋白典型凝膠形成模型

大豆蛋白典型的熱誘導凝膠形成曲線見圖1，每個樣品測試(3次)獲得的流變圖譜從本質(zhì)上來說是完全一致的。從圖1中的3個參數(shù)(G'、G″、tanδ)可以看出大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成過程中流變性質(zhì)的改變。G'表示蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的彈性組成，代表了凝膠結(jié)構(gòu)的強度，對凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有貢獻;G″表示黏性組成，對三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)沒有貢獻。Tanδ值象征著網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的類型，其值越小代表三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越好。

圖1a可以看出，在加熱階段溫度升至80℃前G'和G″基本保持恒定。在此過程中，蛋白質(zhì)分子逐漸變性(去折疊)、疏水基團暴露是凝膠形成的準備階段。當加熱溫度超過85℃后，G'和G″快速上升表明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐步形成。凝膠過程初始階段黏性行為占主導地位(G″＞G')，而在加熱后期彈性行為占據(jù)主導地位(G'＞G″)，此時蛋白質(zhì)分子聚集并且交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此過程為初始凝膠階段;當溫度達到最高95℃后，冷卻階段開始。在此過程中，G'和G″繼續(xù)穩(wěn)定增加，說明蛋白質(zhì)分子繼續(xù)交聯(lián)、凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緩慢形成和重排。Paulson等［10］把油菜蛋白凝膠的形成和穩(wěn)定性歸因于疏水相互作用和氫鍵。因此，可以認為疏水相互作用和氫鍵對大豆蛋白凝膠的形成和穩(wěn)定性起到同樣作用。Tanδ是辨別凝膠構(gòu)造的一個非常重要的參數(shù)。從圖1b可以看出，在85℃之前tanδ逐漸下降，在90℃左右時急劇下降至一個非常低的水平，并且在以后的加熱和冷卻階段保持恒定。這說明在冷卻初始階段大豆蛋白溶液已經(jīng)形成了穩(wěn)定的凝膠，并且在冷卻過程中同時增加了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的彈性和黏性組成。

圖1 典型的大豆蛋白凝膠形成G'，G″模形圖和tanδ模型圖

圖1所示凝膠過程遵循球蛋白熱誘導凝膠3步過程:1):蛋白變性以及疏水基團暴露;2)去折疊的蛋白質(zhì)分子間相互作用(聚集);3)聚集體交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。特別強調(diào)的是在冷卻階段，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)繼續(xù)發(fā)展并且被形成的許多短程鍵(如氫鍵)加強。因此，可以總結(jié)大豆蛋白溶液凝膠網(wǎng)絡(luò)形成主要是疏水相互作用和氫鍵。

對于所有的加熱和冷卻速率，加熱階段所得的流變曲線基本相同，G'和 G″都小于1 Pa，且 G'＜ G″直到到達凝膠點(圖1)。所以比較加熱和冷卻速率對冷卻階段大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響。

2.2 加熱速率對冷卻階段凝膠形成G'值的影響

從圖2a可以看出，在冷卻速率均為2℃/min的情況下，加熱速率越慢，冷卻階段形成的凝膠G'值越大。這可以解釋為在相同冷卻速率下，較慢的加熱速率使大豆蛋白分子有更多的時間去重排和交聯(lián)形成更有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來增加凝膠強度。這與前述Sun等［9］的研究結(jié)論不同，他們發(fā)現(xiàn)慢的加熱速率對豌豆蛋白凝膠形成有不利的影響，這種差異可能是不同的蛋白種類造成的。

圖2 不同加熱和冷卻速率對冷卻階段大豆蛋白溶液的影響

圖3a表示不同加熱速率下熱誘導大豆蛋白凝膠的性質(zhì)。較慢加熱速率(0.5、1℃/min)的G'顯著大于較快加熱速率(2、4℃/min)下形成凝膠的G'值，4℃/min時tanδ顯著高于其他較慢加熱速率時的值。Renkema等［11］認為不同的加熱速率影響蛋白質(zhì)的聚集動力學導致產(chǎn)生不同網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(不同粗細的線股、孔隙等)的凝膠，而不同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)又導致不同的G'值。

圖3 12%大豆蛋白凝膠形成后頻率掃描1 Hz時熱誘導凝膠性質(zhì)

2.3 冷卻速率對冷卻階段凝膠形成G'的影響

圖2b表示冷卻速率對大豆蛋白凝膠形成的影響。在相同加熱速率下，最慢的冷卻速率(0.5℃/min)時大豆蛋白形成最強的凝膠強度。這是因為慢的冷卻速率使蛋白質(zhì)分子有更長的時間處于去折疊態(tài)，放緩了暴露基團的活動性，使其在蛋白質(zhì)分子相互作用前達到最佳的排列。氫鍵是促進大豆蛋白凝膠結(jié)構(gòu)形成的重要因素，較低的溫度則有利于氫鍵的形成，因此可以推測慢的冷卻速率促進氫鍵的形成從而產(chǎn)生更強的凝膠。O'Kane等［12］報道在慢的冷卻速率(0.2℃/min)下疏水作用和二硫鍵與豌豆蛋白的凝膠結(jié)構(gòu)有關(guān)，他們認為慢的冷卻速率為巰基基團反應(yīng)形成二硫鍵提供了充足的時間，凝膠強度增加。眾所周知，親水性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的側(cè)鏈上極性基團可以形成氫鍵并且為去折疊蛋白質(zhì)分子提供鏈接。對于疏水相互作用，非極性氨基酸如丙氨酸、甘氨酸等在球蛋白變性時從分子內(nèi)部暴露出來而更容易形成。

圖3b表示冷卻速率對熱誘導大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響。隨著冷卻速率的增大，G'值減少。Tanδ在較慢冷卻速率時(0.5、1、2℃/min)和快速冷卻速率時(4℃/min)有顯著不同。這是因為在冷卻階段，隨著溫度的下降大豆蛋白分子活動性下降，促進了分子之間化學鍵的形成;慢的冷卻速率下大豆蛋白有充足的時間形成各種作用力從而增大了G'，而較快的冷卻速率則減少了各種作用力的形成從而降低了凝膠的強度，產(chǎn)生了不同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)類型。與加熱速率對凝膠性質(zhì)的影響相比，冷卻速率對大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響相對較大。

2.4 加熱和冷卻速率對冷卻階段凝膠形成G'值的影響

加熱和冷卻速率對大豆蛋白凝膠性質(zhì)同樣有顯著的影響，如圖2c，慢的加熱和冷卻速率比快的加熱和冷卻速率形成的凝膠更強。值得注意的是，在較慢加熱和冷卻速率(0.5、1℃/min)下，G'在冷卻階段初期較大，然后隨著溫度的降低緩慢增大;在較快加熱和冷卻速率(2、4℃/min)時，G'在冷卻初期急劇增大，然后逐漸放緩。這種情況是由于在快的加熱和冷卻速率時，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在冷卻階段繼續(xù)形成，而慢的加熱和冷卻速率時，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在加熱階段形成冷卻階段加強。

改變加熱和冷卻速率同樣影響大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見圖3c。G'隨著加熱和冷卻速率的增大逐漸減少，而tanδ則逐漸的增大。對于G'，其逐漸減少和加熱(冷卻)速率對蛋白凝膠性質(zhì)的影響相一致(見圖3a和圖3b)，進一步證明了慢的加熱(冷卻)速率增強了蛋白質(zhì)分子之間的相互作用并產(chǎn)生了更強的凝膠。而對于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)類型(tanδ決定)，同樣受到加熱和冷卻速率的影響，快的加熱和冷卻速率形成的tanδ較大，說明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中黏性組成較大，這與圖3a和圖3b的結(jié)果相一致。

2.5 加熱和冷卻速率對凝膠點的影響

加熱和冷卻速率對凝膠點的影響結(jié)果如表1所示。隨著加熱速率的增大凝膠點增大，和冷卻速率無關(guān)。這與O'Kane等［12］的結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)在較慢的加熱速率下豌豆蛋白初始凝膠形成的溫度較低。Renkema等［11］發(fā)現(xiàn)大豆蛋白在較快的加熱速率時其變性溫度較高，這就導致較高的凝膠溫度。雞蛋清蛋白、豌豆球蛋白和牛血清蛋白中有同樣的現(xiàn)象［13－14］。因此，可以得出凝膠點和加熱速率有關(guān)。在較低的加熱速率下蛋白質(zhì)分子有更多的時間重組和排列，因此，他們在較低溫度下開始交聯(lián);在較高加熱速率下，蛋白質(zhì)分子沒有足夠的時間去重組和排列，因此，開始交聯(lián)時溫度較高。

冷卻速率對凝膠點無影響，如表1結(jié)果所示。在相同加熱速率不同冷卻速率下，蛋白質(zhì)有相似的凝膠點。當加熱和冷卻速率都改變時，凝膠點只受加熱速率影響。

表1 加熱和冷卻速率對凝膠點的影響(SPI 12%)/℃

2.6 不同濃度對大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)濃度對SPI凝膠性質(zhì)的影響見表2(加熱和冷卻速率2℃/min)。G'值隨著蛋白質(zhì)濃度的增大(從10%～15%)而增大，因為濃度的增大提高了蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的機會從而形成了更強的凝膠構(gòu)造。Tanδ隨著蛋白質(zhì)濃度的增大而減少，說明高的蛋白質(zhì)濃度形成了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更好的凝膠。凝膠點隨著蛋白質(zhì)濃度的增大從95℃降低到72℃，在P＜0.05水平上呈顯著性差異，說明凝膠點和蛋白質(zhì)的濃度相關(guān);這與Sun等［15］的研究結(jié)果不同，他們發(fā)現(xiàn)鹽溶豌豆蛋白的凝膠點與濃度無關(guān)。這可以解釋為在相同的溫度下濃度高的蛋白質(zhì)有更多的機會交聯(lián)，所以高濃度的蛋白質(zhì)溶液在較低的溫度下就開始形成凝膠。

表2 不同濃度對大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響

3 結(jié)論

加熱和冷卻速率影響熱誘導大豆蛋白的凝膠性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。在相同冷卻速率下(2℃/min)，隨著加熱速率的增大(從0.5～4℃/min)，凝膠點逐漸增大而凝膠強度逐漸減小;在相同加熱速率下(2℃/min)，隨著冷卻速率的增大(從0.5～4℃/min)，最終凝膠強度逐漸減小而凝膠點基本保持不變。慢的加熱(冷卻)速率形成更小的tanδ，表明形成更好的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu);慢的加熱(冷卻)速率產(chǎn)生更大的G'值，表明形成更強的凝膠強度;而凝膠點隨著加熱速率的增大而增高，與冷卻速率無關(guān)。增大蛋白質(zhì)濃度可以提高凝膠強度，而tanδ值和凝膠點隨著蛋白質(zhì)濃度的增大而減少。因此，在食品生產(chǎn)中可行的途徑是調(diào)控加熱和冷卻速率以控制大豆蛋白的凝膠強度，生產(chǎn)出最適的凝膠特性，而不用改變蛋白質(zhì)的濃度。

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