程詩明，閔 會(huì)，康志雄，梁君瑛

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究所，浙江 杭州 310052；3. 浙江省林業(yè)廳，浙江 杭州 310020）

香榧天然群體遺傳多樣性分析與評(píng)價(jià)研究

程詩明1，閔 會(huì)2，康志雄3，梁君瑛1

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究所，浙江 杭州 310052；3. 浙江省林業(yè)廳，浙江 杭州 310020）

選取香榧（Torreya grandis cv. Merrillii）主要分布區(qū)具有代表性的6個(gè)群體共92個(gè)個(gè)體的葉片和果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，采用表型和分子標(biāo)記（AFLP）兩種不同的方法分別從不同層次來揭示香榧天然群體的遺傳多樣性。結(jié)果表明：表型與DNA水平多樣性分析兩種方法在揭示香榧遺傳多樣性水平上是一致的，相關(guān)系數(shù)為0.9783，具有較高的相關(guān)吻合性。二者均證實(shí)了香榧天然群體具有較高的遺傳豐富度，且遺傳變異主要集中在群體內(nèi)。

香榧；表型；AFLP分析；遺傳多樣性

香榧（Torreya grandis cv. Merrillii）系裸子植物紅豆杉科（Taxaceae）榧屬（Torreya）常綠喬木。其全身是寶，是集果用、油用、藥用、材用、綠化、觀賞為一體的多用途經(jīng)濟(jì)樹種，尤其以其名貴干果著稱中外。近年來，香榧干果市場(chǎng)緊俏，價(jià)格堅(jiān)挺，加上其優(yōu)良的材用價(jià)值，不少地區(qū)香榧天然群體遭到嚴(yán)重的人為破壞，因此急需對(duì)其開展遺傳多樣性研究以便進(jìn)行種質(zhì)資源保存，搶救基因資源。

本文采用表型及AFLP分子標(biāo)記方法對(duì)香榧主要分布區(qū)6個(gè)主要群體進(jìn)行遺傳多樣性研究，探討其遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分布特點(diǎn)，為香榧遺傳多樣性保護(hù)策略的提出、種質(zhì)資源保存及優(yōu)異種質(zhì)篩選提供科學(xué)合理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集香榧主要分布區(qū)資料，進(jìn)行香榧主要分布區(qū)的隨機(jī)分組取樣。分別采集了浙江省諸暨東白湖、鐘家?guī)X、磐安、紹興、嵊州和安徽省黃山地區(qū)六個(gè)主要群體共92個(gè)個(gè)體的葉片和果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，每個(gè)群體覆蓋其分布區(qū)全部類型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

參照Falkenhagen、Putenikhin、Li等、羅建勛等[1~4]表型測(cè)定方法進(jìn)行香榧表型性狀測(cè)定。

針葉測(cè)定：每單株隨機(jī)選取15枚針葉用直尺測(cè)定針葉的長(zhǎng)度、寬度（中央）。

果實(shí)和種子測(cè)定：游標(biāo)卡尺測(cè)定果實(shí)長(zhǎng)度、寬度（中央直徑），每單株測(cè)定30個(gè)果實(shí)，同時(shí)測(cè)定單果重（不重復(fù)隨機(jī)抽樣）。種子測(cè)定方法同果實(shí)，長(zhǎng)寬測(cè)量單位為cm，精度均為0.01 cm。質(zhì)量測(cè)量單位為g，精度為0.01 g。

以香榧葉片為實(shí)驗(yàn)材料，參考梁丹等[6]的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行相關(guān)AFLP分析。按有或無對(duì)每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶進(jìn)行記錄，選取片段大小在200 ~ 900 bp的清晰條帶為有效條帶。擴(kuò)增條帶存在時(shí)記為1，無帶時(shí)記為0。運(yùn)用POPGENE3.2計(jì)算多態(tài)性條帶（N）、多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I）以及種群內(nèi)總遺傳變異Ht、各種群內(nèi)遺傳變異Hs、種群間遺傳分化系數(shù)Gst和種群間基因流動(dòng)系數(shù)Nm。運(yùn)用ARLEQUIN3.01進(jìn)行種群間遺傳差異的分子方差分析；基于0/1矩陣運(yùn)用NTSYS-pc 2.02進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧天然群體表型多樣性分析

2.1.1 各性狀的方差分析 對(duì)6個(gè)群體的92個(gè)香榧個(gè)體的針葉長(zhǎng)、針葉寬、果實(shí)長(zhǎng)、果實(shí)寬、單果重、種子長(zhǎng)、種子寬、單粒重8個(gè)表型性狀進(jìn)行巢式設(shè)計(jì)方差分析（表1），8個(gè)表型性狀在群體間和群體內(nèi)都存在極顯著差異，說明香榧的表型性狀在群體間和群體內(nèi)存在著廣泛的變異。

表1 香榧各表型性狀的方差分析Table 1 ANOVA on phenotypic traits in T. grandis cv. Merrillii

2.1.2 表型分化 為定量分析香榧8個(gè)表型性狀變異來源，按照巢式設(shè)計(jì)將各表型性狀的變異剖分為群體間變異、群體內(nèi)變異和個(gè)體內(nèi)變異（機(jī)誤），各層次上的方差分量百分比是說明變異來源的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。由表2可以看出，群體間方差分量百分比的平均值為8.7%，群體內(nèi)方差分量百分比的平均值為72.8%。各表型性狀的表型分化系數(shù)（Vst）平均值為10.8%，群體內(nèi)占89.2%，說明絕大多數(shù)變異存在于群體內(nèi)，群體內(nèi)多樣性大于群體間多樣性。

2.1.3 香榧表型變異的多重比較 用變異系數(shù)（CV）表示性狀值離散性特征，變異系數(shù)越大，性狀的測(cè)量值離散程度越大[6]。對(duì)測(cè)定所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算樣本平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差（表3）及變異系數(shù)（表4）。6個(gè)香榧群體各形態(tài)性狀的平均變異系數(shù)為20.28%，其中東白湖群體15.83%、黃山群體27.68%、磐安群體23.03%、紹興群體15.24%、鐘家?guī)X群體18.49%、嵊州群體21.43%。香榧不同形態(tài)性狀的平均變異程度由大到小的順序?yàn)椋簡(jiǎn)瘟Ｖ亍喂?、針葉長(zhǎng)、種子寬、針葉寬、種子長(zhǎng)、果實(shí)長(zhǎng)、果實(shí)寬。說明各性狀中，果實(shí)寬相對(duì)穩(wěn)定。不同群體各形態(tài)性狀平均變異系數(shù)由大到小順序?yàn)椋狐S山、磐安、嵊州、鐘家?guī)X、諸暨東白湖、紹興。初步判斷遺傳多樣性豐富區(qū)在黃山、磐安一帶。

表2 香榧表型性狀方差分量及群體間與群體內(nèi)表型分化系數(shù)Table 2 Variance component and differentiation coefficients of phenotypic traits in T. grandis cv. Merrillii

表3 香榧天然群體各性狀平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差Table 3 Mean and standard deviation of phenotypic traits in T. grandis cv. Merrillii populaions

表4 香榧天然群體各性狀變異系數(shù)Table 4 Coefficient of variation of phenotypic traits in T. grandis cv. Merrillii populations

2.1.4 香榧天然群體表型性狀聚類分析 對(duì)針葉、果實(shí)、種子表型數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果如圖1所示。由圖中可以看出，以相似系數(shù)0.70劃分，可將6個(gè)香榧天然群體劃分為三類，其中諸暨鐘家?guī)X群體、東白湖群體與嵊州群體歸為一大類。黃山群體與紹興群體聚為一類，磐安群體獨(dú)自聚為一類。2.2 香榧天然群體遺傳多樣性的AFLP分析

圖1 香榧天然群體表型性狀聚類結(jié)果Figure 1 The cluster map of phenotypic traits in T. grandis cv. Merrillii populations

2.2.1 遺傳多樣性分析 8對(duì) AFLP引物共檢測(cè)出364條譜帶，其中多態(tài)性譜帶63個(gè)。衡量種群遺傳多樣性最常用的指標(biāo)有多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)比例、觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)。香榧天然群體在物種水平上的多態(tài)位點(diǎn)百分率高達(dá)100%（表5），從單個(gè)群體來看，香榧物種水平和群體水平的遺傳多樣性均比較高，各群體的多態(tài)位點(diǎn)百分率在79.73% ~ 98.41%，Nei基因多樣性為 0.309 6 ~ 0.376 8， Shannon信息指數(shù)為0.454 8 ~ 0.547 1，等位基因數(shù)為1.793 9 ~ 1.984 1，有效等位基因數(shù)為1.541 6 ~ 1.675 9。運(yùn)用基因譜帶頻率方差分析比較群體間與群體內(nèi)遺傳多樣性水平，結(jié)果顯示，香榧群體的遺傳多樣性主要存在于群體內(nèi)（88.86%），群體內(nèi)的變異明顯大于群體間。

表5 香榧群體遺傳多樣性水平（括號(hào)內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)差）Table 5 Genetic diversity within population in T. grandis cv. Merrillii populations

2.2.2 基因譜帶頻率方差分析 對(duì)6個(gè)供試群體AFLP標(biāo)記的譜帶進(jìn)行ANOVA方差分析（表6），結(jié)果表明：在譜帶頻率總方差的貢獻(xiàn)中，群體間占 11.14%，群體內(nèi)占88.86%，研究群體的遺傳多樣性主要分布在群體內(nèi)；群體間譜帶頻率存在差異不明顯（F = 1.425 3），基因譜帶頻率在群體間差異不明顯。

表6 香榧群體AFLP分子標(biāo)記譜帶頻率方差分析（ANOVA）Table 6 ANOVA on band frequencies of AFLP from 6 T. grandis cv. Merrillii populations

2.2.3 遺傳分化 6個(gè)香榧群體種水平上的遺傳多樣性為0.396 3，群體間遺傳多樣性為0.045 1，群體內(nèi)遺傳多樣性為0.351 2，群體間遺傳多樣性占11.38%，群體內(nèi)遺傳多樣性占88.62%，群體內(nèi)的遺傳多樣性大于群體間的遺傳多樣性。香榧群體間存在一定的分化，其遺傳分化系數(shù)為0.1136。香榧群體種水平上的基因流（Nm）為3.899 7[8~9]表明香榧群體間存在基因交流，且交流比較頻繁[10]。

2.2.4 遺傳一致度和遺傳距離 6個(gè)香榧群體遺傳一致度比較大，平均值為0.917 4，遺傳距離平均值為0.079 7，說明香榧群體之間存在一定程度的分化[10]。另外，I與D值還表明各群體間的遺傳關(guān)系，由表 7中可以看出，鐘家?guī)X群體與磐安群體間的遺傳關(guān)系最近（I = 0.9655, D = 0.0351）；黃山群體與鐘家?guī)X群體、東白湖群體之間的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)（D = 0.1267）。

表7 群體間的遺傳一致度和遺傳距離Table 7 The genetic identity(I) and genetic distance(D) within population

圖2 6個(gè)香榧群體遺傳一致度UPGMA聚類Figure 2 UPGMA dendrogram of using Nei’s unbiased genetic identity

2.2.5 UPGMA聚類分析 采用NTSYS軟件進(jìn)行UPGMA聚類得到6個(gè)香榧群體的遺傳一致度聚類圖（圖2）。由圖2可以看出，以相似系數(shù)0.10進(jìn)行劃分，可以將6個(gè)群體歸為4個(gè)類群，黃山群體和鐘家?guī)X群體歸為一類；紹興群體和東白湖群體歸為一類；嵊州群體和磐安群體各自聚為一類。

3 結(jié)論

3.1 遺傳分化系數(shù)

6個(gè)香榧群體表型性狀變異系數(shù)平均值為20.28%，DNA水平上的遺傳多樣性（Ht）為0.3963，均說明了香榧天然群體具有較為豐富的遺傳多樣性，遺傳變異豐富。

表型性狀方差分量剖分表明，群體間方差分量占8.7%，群體內(nèi)占72.8%，機(jī)誤占18.5%，群體間的表型分化系數(shù)為10.8%；DNA水平上群體內(nèi)的遺傳多樣性占88.62%，群體間的遺傳多樣性占11.38%，且在AFLP譜帶頻率總方差的貢獻(xiàn)中（AMOVA方差分析），群體間占11.14%，群體內(nèi)占88.86%。由此可見，表型與DNA水平多樣性分析結(jié)果一致，均說明了香榧天然群體的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，群體內(nèi)變異大于群體間。

3.2 遺傳多樣性特點(diǎn)及分布規(guī)律

根據(jù)香榧表型性狀的變異數(shù)（CV）以及表型分化變異（Vst），初步判定香榧表型變異豐富區(qū)在黃山、磐安一帶，表型變異最低的是諸暨東白湖、紹興一帶。根據(jù)AFLP分析中各群體的多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）以及Shannon信息指數(shù)（I），確定供試6個(gè)香榧群體中變異豐富區(qū)在磐安、嵊州一帶，變異最低的在黃山、紹興一帶。由此可見，表型多樣性與DNA水平多樣性分布除黃山群體外基本趨于一致，磐安群體無論是表型還是DNA水平遺傳豐富度都較高，而紹興群體的遺傳豐富度則相對(duì)為最低。磐安地區(qū)屬于古香榧富集區(qū)，基因資源相對(duì)較為豐富，在后期的發(fā)展過程中，受外部條件影響也相對(duì)較小，因此無論是表型還是DNA水平，都具有較高的遺傳豐富度。而紹興地區(qū)曾是香榧會(huì)稽山區(qū)的主產(chǎn)區(qū)，但是由于細(xì)榧價(jià)格是米榧的三倍以上，造成大量非細(xì)榧類型被高接換品種，再加上香榧雌雄異株，產(chǎn)區(qū)農(nóng)民為增加產(chǎn)量，進(jìn)行人工授粉，雄株大量砍伐，造成遺傳多樣性降低。而對(duì)于黃山地區(qū)來說，其所產(chǎn)香榧主要是米榧系列，其基因資源并沒有較大的遺傳豐富度，但是由于表型受環(huán)境影響影響比較大，則表現(xiàn)出了較為豐富的遺傳多樣性。

3.3 反映遺傳分化參數(shù)的典型相關(guān)分析

在SAS軟件用CANCORR過程實(shí)現(xiàn)表型多樣性與AFLP多樣性的典型相關(guān)分析。選擇表型多樣性參數(shù)變異系數(shù)（CV）作為第一組變量，AFLP多樣性參數(shù)多臺(tái)百分率（P）、基因多樣性（H）、Shannon信息指數(shù)（I）作為第二組變量，進(jìn)行典型相關(guān)分析，結(jié)果如表8示。典型相關(guān)系數(shù)為0.978 3，且在顯著性檢驗(yàn)中P值達(dá)到0.063 6，說明二者具有較高的相關(guān)性，進(jìn)一步揭示了表型與DNA水平多樣性分析結(jié)果的一致性、科學(xué)性。

表8 典型相關(guān)系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Table 8 The canonical correlation coefficient and test of H0

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用表型與DNA分子標(biāo)記兩個(gè)層次來揭示香榧天然群體的遺傳多樣性，二者結(jié)果一致，最終都表明香榧天然群體具有較高的遺傳多樣性，且遺傳變異主要集中在群體內(nèi)，群體內(nèi)變異明顯大于群體間。表型多樣性研究結(jié)果表明，6個(gè)香榧群體平均變異系數(shù)為20.28%，群體間的表型分化系數(shù)為10.8%；DNA水平研究結(jié)果顯示，6個(gè)香榧群體總的遺傳多樣性（Ht）為0.396 3，群體分化系數(shù)（Gst）為0.113 6。

香榧天然群體的遺傳多樣性主要集中在群體內(nèi)，因此在進(jìn)行香榧種質(zhì)資源保存時(shí)，可根據(jù)現(xiàn)有情況充分利用，除可以進(jìn)行異地保存，建立異地保存林外，有些遺傳多樣性較高的群體，遺傳變異豐富，可以直接進(jìn)行原地保存。而對(duì)于香榧遺傳改良來說，在重視群體間選擇的同時(shí)，可增大群體內(nèi)選擇的力度，進(jìn)而推薦優(yōu)異種質(zhì)或品種用于生產(chǎn)，促使香榧的發(fā)展走向產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；?。

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Genetic Diversity of Different Populations in Torreya grandis cv. Merrillii

CHENG Shi-ming1，MIN Hui2，KANG Zhi-xiong3，LIANG Jun-ying4
（1. Zhejiang For estry Academy, H angzhou 310023, China; 2. Modern Chinese Medicine and Natural Me dicine Research Institute of Zhe jiang, Hangzhou 310052, China; 3. Zhejiang Forestry Department, Hangzhou 310020, China）

Leaves and fruits were collected from 92 Torreya grandis cv. Merrillii trees of 6 representative populations in Zhejiang and Anhui province. Phenotypic identification and amplified fragment length polymorphism (AFLP) were used to analyze the genetic diversity. The correlation coefficient between phenotypic diversity and genetic diversity of different populations by AFLP was 0.9783, which proved the consistency of the two results. It also proved that T. grandis cv. Merrillii had a high genetic diversity and the variation is mainly within populations.

Torreya grandis cv. Merrillii; phenotypic; AFLP analysis; genetic diversity

S718.46

A

1001-3776（2014）04-0011-06

2014-03-24；

2014-06-05

“十一五”國家科技支撐課題“林木、花卉基因資源發(fā)掘與種質(zhì)創(chuàng)新利用研究”子課題“東亞熱帶林木基因資源創(chuàng)新利用研究”（2006BAD13B07-9）、浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“香榧天然群體遺傳多樣性研究與優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)新利用”（Y306613）、浙江省科研院所專項(xiàng)“浙江省特色經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)資源的收集、保存與創(chuàng)新利用研究”（2006F11002）、浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目“森林食品研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與人才培養(yǎng)“（2012F20012）、浙江省森林食品研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2011F10069）的研究?jī)?nèi)容。

程詩明（1975－），男，安徽安慶人，副研究員，博士，從事林木遺傳育種研究。