孫 琳，李曉燕，張俊紅，林二培，童再康

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

亮葉樺微扦插快繁技術(shù)研究

孫 琳，李曉燕，張俊紅，林二培，童再康*

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

以亮葉樺（Betula luminifera）4個(gè)優(yōu)良無(wú)性系為材料，通過(guò)1/2 MS、MS、B5、MS?B5四種基本培養(yǎng)基和分段扦插的方法篩選亮葉樺微扦插的最佳培養(yǎng)基以及外植體的最適莖段部位。結(jié)果表明：亮葉樺株高、根數(shù)、根長(zhǎng)性狀在不同培養(yǎng)基間存在極顯著或顯著差異，多重比較表明株高和根數(shù)表現(xiàn)最佳培養(yǎng)基為MS?B5，根長(zhǎng)性狀表現(xiàn)最佳培養(yǎng)基為B5。以不同部位的莖段為外植體，4個(gè)無(wú)性系在MS?B5培養(yǎng)基中微扦插，其株高和根數(shù)性狀存在極顯著差異，葉寬生長(zhǎng)存在顯著差異，而根長(zhǎng)和葉長(zhǎng)無(wú)顯著差異，以株高生長(zhǎng)為選擇指標(biāo)，最佳外植體為中下部莖段，以根數(shù)為選擇指標(biāo)，中上部莖段作為外植體優(yōu)于下部莖段。綜合分析表明，以中部莖段為外植體，選用MS?B5培養(yǎng)基，可適用于亮葉樺不同無(wú)性系的微扦插快繁。

亮葉樺；微扦插；無(wú)性系

微型扦插技術(shù)（microcutting）又稱(chēng)為單芽莖段培養(yǎng)或者單節(jié)莖段培養(yǎng)，是指離體培養(yǎng)帶一個(gè)芽的莖段（單個(gè)莖節(jié)或微型插條），使頂芽或腋芽發(fā)育成苗。它與傳統(tǒng)的扦插極為類(lèi)似，但是微型扦插一般不需要添加外源激素來(lái)打破頂端優(yōu)勢(shì)，有時(shí)也可加入少量生長(zhǎng)素，不僅促使腋芽萌發(fā)，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生較好的生根效果[1]。微型扦插技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)體外無(wú)菌培養(yǎng)，在一個(gè)很小的范圍以及有限的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，用盡可能少的外植體材料繁殖出盡可能多的植株[2~4]。近年來(lái)微型扦插技術(shù)在茶樹(shù)、北美海棠、木薯等木本植物育種中廣泛應(yīng)用[5~7]，而關(guān)于亮葉樺的微型扦插繁育技術(shù)目前尚未報(bào)道。

亮葉樺（Betula luminifera）是我國(guó)一種優(yōu)良速生闊葉樹(shù)種，其材質(zhì)優(yōu)良，是制作高級(jí)家具的優(yōu)良材料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和使用價(jià)值[8]。亮葉樺無(wú)性繁殖技術(shù)，尤其扦插繁殖技術(shù)，需要在特定的季節(jié)和環(huán)境條件下方可進(jìn)行[9~12]。通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，控制培養(yǎng)條件，可降低外界環(huán)境對(duì)植株生長(zhǎng)的影響，縮短培養(yǎng)周期，有效加快林木種苗產(chǎn)業(yè)化和林木良種化的過(guò)程[13]。亮葉樺組培快繁的研究已有相關(guān)報(bào)道，作為亮葉樺快繁體系的基本要求，必須具備高效性和穩(wěn)定性[14~15]。微型扦插繁殖技術(shù)既可以獲得一定數(shù)目的、大小基本一致的亮葉樺種苗，又可以將其優(yōu)良性狀得以保持和延續(xù)，在一定程度上可解決品種化的問(wèn)題。因此，微型扦插繁殖技術(shù)對(duì)亮葉樺種苗的生產(chǎn)具有十分重要的意義。

本研究選取亮葉樺組培苗莖段為外植體，系統(tǒng)地研究亮葉樺4種無(wú)性系不同部位的莖段在4種不同基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，以此確立不同無(wú)性系的最適培養(yǎng)基以及最佳莖段，以建立高效的亮葉樺微型扦插體系，為亮葉樺的良種選育和優(yōu)良無(wú)性系繁育提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本次試驗(yàn)材料均為亮葉樺子代測(cè)定林中優(yōu)良單株，嫁接定植于浙江農(nóng)林大學(xué)平山苗圃，所用外植體均為優(yōu)良單株嫁接苗的幼芽培育的無(wú)菌苗，保存于組培室。

1.2 基本培養(yǎng)基

本試驗(yàn)選取4種基本培養(yǎng)，分別為1/2 MS、MS、B5、MS?B5，其中MS?B5培養(yǎng)基為改良培養(yǎng)基，其無(wú)機(jī)鹽成分采用MS的配方，有機(jī)成分采用B5的配方。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 最佳培養(yǎng)基的篩選 在無(wú)菌操作臺(tái)上，剪取亮葉樺不同無(wú)性系（優(yōu)3、優(yōu)30、G49-3和G50-1）的莖段（長(zhǎng)約1.5 cm，保留一個(gè)腋芽、半片葉片為宜），扦插于4種基本培養(yǎng)基中，每瓶接5個(gè)外植體，每組10瓶，放入培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度控制在25±2℃，光/暗周期16h/8h，光照強(qiáng)度1 000 ~ 15 000 lx，一個(gè)月后，對(duì)其株高、根數(shù)、根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬性狀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 不同部位莖段作為外植體的扦插比較 將不同無(wú)性系的莖段分為上、中、下三個(gè)部分分別接種到最佳基本培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)30 d后，對(duì)其株高、根數(shù)、根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬性狀進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 微扦插基本培養(yǎng)基的篩選

表1 不同無(wú)性系莖段在不同培養(yǎng)基的生根與植株生長(zhǎng)情況Table 1 Growth of different stem segments in different mediums

亮葉樺微型扦插一個(gè)月后觀測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明（表 1），株高生長(zhǎng)在不同培養(yǎng)基間存在極顯著差異，而在各無(wú)性系間無(wú)顯著差異；生根數(shù)在不同培養(yǎng)基和不同無(wú)性系中均存在極顯著差異；根長(zhǎng)在不同培養(yǎng)基中存在顯著差異，而各無(wú)性系間差異不顯著；葉長(zhǎng)和葉寬在不同培養(yǎng)基和無(wú)性系間均無(wú)顯著差異（表 2）。經(jīng)株高、根數(shù)和根長(zhǎng)性狀的多重比較表明，株高生長(zhǎng)表現(xiàn)最好的最佳培養(yǎng)基為MS?B5，各無(wú)性系在MS?B5培養(yǎng)基中的株高均達(dá)4.00 cm以上，其次為B5培養(yǎng)基，為3.00 cm以上，顯著優(yōu)于1/2MS和MS培養(yǎng)基；根數(shù)性狀表現(xiàn)最好的培養(yǎng)基為MS?B5，各無(wú)性系均達(dá)4條以上；根長(zhǎng)生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基為B5，各無(wú)性系根長(zhǎng)均可達(dá)9.03 cm（表1）。

2.2 不同部位莖段的扦插比較

以不同部位的莖段為外植體，4個(gè)無(wú)性系在MS?B5培養(yǎng)基中微扦插，一個(gè)月后對(duì)其株高、根數(shù)、根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)和葉寬性狀進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如表3。方差分析表明，其株高和根數(shù)性狀存在極顯著差異，葉寬生長(zhǎng)存在顯著差異，而根長(zhǎng)和葉長(zhǎng)無(wú)顯著差異；株高和葉寬性狀在不同無(wú)性系間存在極顯著差異，而根數(shù)、根長(zhǎng)和葉長(zhǎng)無(wú)顯著差異（表4）。為篩選最佳的莖段部位為外植體，多重比較后表明，以株高生長(zhǎng)為選擇指標(biāo)，亮葉樺微扦插的最佳外植體為中下部莖段，如優(yōu)3無(wú)性系中下部莖段為外植體，1個(gè)月后株高可達(dá)4.40 cm，而上部莖段株高僅3.40 cm；以根數(shù)為選擇指標(biāo)，中上部莖段作為外植體優(yōu)于下部莖段，表現(xiàn)為4種無(wú)性系以下部莖段為外植體時(shí)生根數(shù)僅有 2 ~ 3根，而中上部莖段的生根數(shù)可達(dá)5 ~ 6根。

表2 不同無(wú)性系在不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)的方差分析Table 2 ANOVA on growth of four clones in different medium

3 結(jié)論與討論

微型扦插是利用植物的再生機(jī)能，將離體的植物營(yíng)養(yǎng)器官（根、莖、葉等）插入一定的培養(yǎng)基中，在適宜的培養(yǎng)條件下，通過(guò)自身遺傳以及生理機(jī)能調(diào)節(jié)使離體的營(yíng)養(yǎng)器官再生成一個(gè)完整新植株。這種繁殖方法與嫁接等無(wú)性繁殖方法相比，具有繁殖系數(shù)高、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)；與播種等有性繁殖方法相比，具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。雖然微型扦插作為一種成熟的無(wú)性繁殖技術(shù)在多個(gè)不同林木中應(yīng)用，但仍有多種不同因素影響微型扦插的效果。

表3 不同莖段部位外植體在MS?B5中的生根與植株生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of different segments from four clones in MS?B5

培養(yǎng)基的成分對(duì)微型扦插植株的生長(zhǎng)有重要的影響，在培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)添加外源激素容易促使植株變異[16]，因此本研究所用培養(yǎng)基均未添加任何激素。本研究所用4種培養(yǎng)基的配方完全不同，植株的生長(zhǎng)差異較大，因此推測(cè)培養(yǎng)基成分對(duì)亮葉樺株高、根系生長(zhǎng)萌發(fā)起到關(guān)鍵作用。MS?B5與MS的差別主要在于有機(jī)成分以及肌醇用量的不同，MS中含有甘氨酸，并且肌醇的用量偏多，而MS?B5培養(yǎng)基不含甘氨酸，且肌醇用量降低一半，反而長(zhǎng)勢(shì)較好，因此在亮葉樺微型扦插的生長(zhǎng)過(guò)程中甘氨酸不是必須的。雖然甘氨酸可轉(zhuǎn)化合成其他有機(jī)物質(zhì)，但成年植物可通過(guò)其他途徑自身合成甘氨酸，亮葉樺通過(guò)帶芽莖段微型扦插時(shí)，可通過(guò)葉片合成甘氨酸，因此不需要外源甘氨酸提供。肌醇的主要生理作用在于參與碳水化合物代謝，磷脂代謝及離子乎衡作用，對(duì)組織快速生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，對(duì)胚狀體和芽的形成有良好影響。由于它可以從磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變而成，因此有時(shí)可以降低濃度使用。維生素在植物材料的生長(zhǎng)中起著重要作用，它們以輔酶的形式參與生物催化劑——酶系的活動(dòng)，參與細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂肪、糖代謝等重要生命活動(dòng)。維生素B1與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有密切關(guān)系，維生素B6對(duì)根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。煙酸對(duì)植物的代謝過(guò)程和胚的發(fā)育都有一定作用。有的外植體，愈傷組織能夠合成維生素，可以不必添加，但生長(zhǎng)早期往往因缺乏合成而需加入。

此外扦插莖段的生理狀態(tài)以及樹(shù)種本身的遺傳特性對(duì)植株的生長(zhǎng)也有影響。在林木的無(wú)性繁殖過(guò)程中存在成熟效應(yīng)和位置效應(yīng)，年齡越大的莖段扦插生根率越低，長(zhǎng)勢(shì)也越差。本研究中亮葉樺4個(gè)無(wú)性系在相同培養(yǎng)條件下，上部莖段的生長(zhǎng)表現(xiàn)普遍差于中下部莖段，而在林木生長(zhǎng)過(guò)程中，頂端的生理年齡最老，因此頂端的枝條無(wú)性繁殖能力最差。

[1] 吳偉民，袁驥，錢(qián)亞明，等. 宿曉紅葡萄單芽莖段組織培養(yǎng)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（5）：98－100.

[2] 朱學(xué)棟，劉奕清，趙榮隆，等. 紅陽(yáng)獼猴桃快速繁殖體系的建立[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（11）：2 369－2 371.

[3] 劉國(guó)民，李娟玲，王英義，等. 黃秋葵組培快繁的研究[J]. 云南植物研究，2002，24（4）：521－524.

[4] 劉彤，趙虎基，陳芳，等. 啤酒花莖段培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2000，20（5）：778－783.

[5] 趙志新. 北美海棠微扦插繁殖試驗(yàn)[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，18（1）：123－125.

[6] 曾亮，蔡麗婭，黃建安，等. 茶樹(shù)微繁殖技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 福建茶葉，2006（1）：3－6.

[7] 何海旺，何隆飛，莫克，等. 木薯新品種新選048離體微扦插快速繁殖技術(shù)[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（4）：307－309.

[8] 胡曉媛，李志真，梁一池. 優(yōu)良速生樹(shù)種光皮樺研究進(jìn)展[J]. 福建林業(yè)科技，2006，33（2）：159－163.

[9] 陳存及，劉春霞，陳登雄，等. 光皮樺扦插繁殖試驗(yàn)研究[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22（2）：101－104.

[10] 雷凌菁，陳偉，耿玉敏. 光皮樺扦插育苗技術(shù)研究[J]. 林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2004，18（6）：51－52.

[11] 官九紅. 光皮樺扦插育苗試驗(yàn)[J]. 防護(hù)林科技，2011（1）：51－52.

[12] 廖柏林. 光皮樺無(wú)性繁殖技術(shù)研究[J]. 林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2006，20（3）：60－63.

[13] 陳偉，林鎮(zhèn)斌，鄭郁善. 光皮樺組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 福建林業(yè)科技，2006，33（1）：67－71.

[14] 諶紅輝. 光皮樺組培快繁技術(shù)獲得成功[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2005（3）：335.

[15] 孫曉敏，陳爭(zhēng)，李美飛，等. 光皮樺組織培養(yǎng)離體再生研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2012，32（3）：604－610.

[16] 胡鑫，徐全樂(lè). 連續(xù)組織培養(yǎng)引起大巖桐再生植株的表型變化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010（5）：167－170.

Experiment on Micro-cutting for Rapid Propagation of Betula luminifera

SUN Lin，LI Xiao-yan，ZHANG Jun-hong，LIN Er-pei，TONG Zai-kang*
（Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

Four different clones of Betula luminifera were selected for experiment of microcutting propagation in four types of medium with different stem segments. The results showed that the height, rooting numbers and root length of cuttings had significant differences among different mediums. Multiple comparisons showed that the optimal medium was MS?B5 for height growth and rooting numbers, and B5 for root length. Different stem segment of four clones in MS?B5 had significant differences of height growth, rooting numbers, and leaf width, except root length and leaf length. The experiments indicated that the explants from lower stem segments had better height growth, while the upper stem segments had more rooting numbers.

Betula luminifera; micro-cutting; clones

S723.1

B

1001-3776（2014）04-0079-04

2014-01-10；

2014-05-25

浙江省竹木育種重大專(zhuān)項(xiàng)“光皮樺優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)新品種選育及推廣示范”（2012C12908-8）

孫琳（1988－），女，上海人，碩士生，從事林業(yè)生物技術(shù)研究；*通訊作者。