孔高飛，金 敏，朱蓮蓮，林高強，劉小川

（浙江理工大學生物工程研究所，杭州310018）

一種短小芽孢桿菌分離鑒定及培養(yǎng)條件研究

孔高飛，金 敏，朱蓮蓮，林高強，劉小川

（浙江理工大學生物工程研究所，杭州310018）

為實施城市垃圾滲透液的生物無害化處理，分離、篩選、鑒定，獲得特定菌株，并對其最適培養(yǎng)條件和最佳培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化。從城市垃圾填埋場垃圾滲透液中分離芽孢桿菌，通過設計特異性引物進行PCR反應鑒定目的菌株。此菌細胞呈現(xiàn)桿狀，革蘭氏陽性，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌。采用單因素實驗和正交實驗法對菌株生長適宜的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基主要成分為：玉米淀粉0.1%，酵母提取物1.0%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%，MgSO4·7H2O 0.49%。在這種條件下，菌株培養(yǎng)10 h，其OD320由1.44上升到6.93，為該菌株的深入研究和應用奠定了基礎。

垃圾滲透液；短小芽孢桿菌；鑒定；培養(yǎng)條件優(yōu)化

0 引 言

隨著社會的高速發(fā)展，越來越多的廢棄物被排放到環(huán)境中，有些化合物含有劇毒，有致癌的作用，且很難自然降解。這些有害的物質隨著垃圾滲透液，對周圍地下水和土壤造成了嚴重的污染。治理環(huán)境污染已經(jīng)成為世界各國努力攻克的難題?？茖W家們采用化學、物理方法結合生物方法來處理污染物，其中微生物方法治理環(huán)境有明顯的優(yōu)勢。但是由于人們?nèi)粘Ｉ钪谢旧喜粚M行分類，導致了生活垃圾滲透液中金屬離子含量很高，一些降解垃圾的菌株抗性差，處理垃圾效果不明顯。因此亟待開發(fā)出一種高表達的、抗性強的，且能夠降解垃圾滲透液的優(yōu)良菌株。已經(jīng)有研究報道短小芽孢桿菌（BaciLLus pumiLus）對降解垃圾有很好的效果［1］，且短小芽孢桿菌由于繁殖速度快，能產(chǎn)生穩(wěn)定的芽孢，抗逆能力強，成為了越來越受矚目的生防材料之一。

短小芽孢桿菌為芽孢桿菌屬的一種，顯微鏡下觀察營養(yǎng)細胞為桿狀，革蘭氏反應陽性［2］，能運動。菌落形態(tài)有半透明狀和不透明狀兩種［3］。短小芽孢桿菌能夠分泌活性很強的纖維素酶、脂肪酶［4］、木聚糖酶［5］和果膠裂解酶［6］等，有利于降解大分子物質。還可以產(chǎn)生抗菌素及抗菌蛋白等拮抗性物質［7］，抑菌范圍廣［8］，對多種病原菌都有抑制作用［9］。產(chǎn)生的聚-γ-谷氨酸可用于降解塑料［10］。黃慶［11］從成都市垃圾中分離得到一株短小芽孢桿菌能夠產(chǎn)生脫毛蛋白酶，利用該蛋白酶采用酶法脫毛技術應用在皮革工業(yè)中，對解決皮革的環(huán)境污染問題有著重要的意義。Fakhfakh等［12］也報道了短小芽孢桿菌A1菌株能降解羊毛廢棄物。短小芽孢桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生的蛋白酶組成洗滌劑去污效果好［13］，提高了洗滌劑的利用率。Panbangred等［14］報道短小芽孢桿菌產(chǎn)生的木聚糖酶具有良好的耐堿性，能夠進行生物漂白，可以降低有機氯化物，減少環(huán)境污染。Geetha等［15］通過優(yōu)化含有農(nóng)業(yè)廢棄物的培養(yǎng)基，提高了短小芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)廢棄物中產(chǎn)木聚糖酶的水平，降低了生產(chǎn)木聚糖酶的成本，又利用了廢棄物，減少污染。游春平等［16］分離得到的短小芽孢桿菌對稻瘟病菌有一定的抑制作用。Akhtar［17］在治療鷹嘴豆根腐病時，采用短小芽孢桿菌制劑獲得了很好的防治效果。張蕾［18］篩選到一株短小芽孢桿菌TY079，對黃瓜枯萎病、棉花黃萎病具有顯著的抑制作用。

由此可以看出短小芽孢桿菌在環(huán)境治理、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領域都有廣闊的應用前景。本文致力于從城市生活垃圾填埋場滲透液中分離得到一株短小芽孢桿菌，研究其最適培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件，使培養(yǎng)基的各組分之間保持平衡，得到菌株的最適生長環(huán)境，可以降低培養(yǎng)成本提高產(chǎn)率，為該菌株的工業(yè)和城市垃圾滲透液處理應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

由某地城市垃圾填埋場滲透液中分離篩選所得。

1.1.2 基礎培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）

牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖0.25%，NaCl 0.5%，用NaOH調p H至7.2，121℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基向其中加1.6%的瓊脂。

1.1.3 主要試劑

溶菌酶、蛋白酶K、r Taq酶、CTAB、牛肉膏、KNO3、NH4NO3、蛋白胨、酵母提取物、NaCl、葡萄糖、蔗糖、MgSO4·7H2O、玉米淀粉、紅薯淀粉、Zn-SO4·7H2O、馬鈴薯淀粉、小麥淀粉和KH2PO4+ K2HPO4（1∶1）復合鹽。

1.1.4 儀器設備

NANODROP 2000分光光度計（Thermo SCIFNTIFIC）、SynGene凝膠成像系統(tǒng)（Syngene）、PCR儀（S1000 Thermal Cycler）、連續(xù)光譜酶標儀（Molecu Lar Devices公司）、電泳儀（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 短小芽孢桿菌的鑒定

1.2.1.1 形態(tài)鑒定

采集某地城市生活垃圾填埋場滲透液，對滲透液中的細菌進行富集培養(yǎng)。將富集培養(yǎng)的菌液在NA固體培養(yǎng)基上進行稀釋涂布分離培養(yǎng)。觀察菌株的菌落形態(tài)，挑取可疑菌落，培養(yǎng)24 h并染色，在顯微鏡下觀察，依據(jù)《常見細菌鑒定手冊》［19］初步認定是芽孢桿菌者，進行單菌分離富集培養(yǎng)。

1.2.1.2 特異性PCR分析鑒定

采用直接PCR擴增菌種DNA檢測技術。直接PCR技術是只針對細菌的16S rRNA基因堿基序列中的特異序列的部分進行分析，設計出幾對特異性引物，PCR擴增16S rRNA基因的特異性片段，通過分析擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，根據(jù)目的條帶的大小來判斷所得到的條帶是否為目的條帶。將分離得到的菌株接種于NA培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)10 h。采用改進的CTAB法提取菌株的總基因組。通過對短小芽孢桿菌16S rRNA堿基序列及gyrA、rpoA基因序列的分析，設計出6對特異性引物（表1），通過對菌株的總基因組進行特異性PCR擴增反應，分析其電泳結果圖，進一步從分子水平來鑒定分離得到的菌株是否為短小芽孢桿菌。PCR擴增程序為：94℃預變性3 min；94℃40 s，61.7℃40 s，72℃45 s，循環(huán)33次；72℃延伸10 min。

表1 特異性PCR引物

1.2.2 短小芽孢桿菌的培養(yǎng)方法

1.2.2.1 菌種活化

將分離得到的短小芽孢桿菌菌株轉接到NA固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，備用。

1.2.2.2 種子液的制備

挑取單菌落，接入裝量為20 mL NA培養(yǎng)基的100 mL三角搖瓶中，置于控溫搖床，37℃，220 r/ min培養(yǎng)12 h，備用。

1.2.3 短小芽孢桿菌培養(yǎng)基的單因素實驗

1.2.3.1 碳源種類及濃度對短小芽孢桿菌生長的

影響

以NA培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、馬鈴薯淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉和玉米淀粉作為基礎培養(yǎng)基的碳源，其他組分不變。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，10 h后，采用酶標儀，測定菌液的OD320，以確定培養(yǎng)基的最佳碳源。確定最佳碳源之后，改變基礎培養(yǎng)基中最佳碳源的質量分數(shù)，其他組分不變，來進一步研究不同濃度的碳源對菌體生長的影響（每次處理重復3次，以下所有處理均重復3次）。

1.2.3.2 氮源種類及濃度對短小芽孢桿菌生長的影響

以NA培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別用有機氮源蛋白胨、酵母提取物和無機氮源KNO3、NH4NO3作為基礎培養(yǎng)基的氮源，基礎培養(yǎng)基中的其他組分不變，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，10 h后，采用酶標儀測定菌液的OD320，以確定培養(yǎng)基的最佳氮源。確定最佳氮源之后，通過改變最佳氮源的質量分數(shù)，來進一步研究不同濃度的氮源對菌體生長的影響。

1.2.3.3 無機鹽離子對短小芽孢桿菌生長的影響

分別用0.5%的NaCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和KH2PO4+K2HPO4（1∶1）復合鹽作為基礎培養(yǎng)基的無機鹽，以不加無機鹽的基礎培養(yǎng)基為空白對照，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，10 h后，采用酶標儀測定菌液的OD320，以確定最佳無機鹽。確定最佳無機鹽之后，通過改變最佳無機鹽的質量分數(shù)，來進一步研究不同濃度無機鹽對菌體生長的影響。

1.2.4 正交實驗設計

通過單因素實驗，確定了短小芽孢桿菌生長所需碳源、氮源及無機鹽的零水平。將篩選出的最佳碳源、氮源和無機鹽3個重要因素，選用3因素3水平L9（33）正交表進行實驗，以尋求培養(yǎng)基中各組分的最佳配比。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

通過正交實驗確定培養(yǎng)基各組分的最佳配比。采用最適培養(yǎng)基配方進行發(fā)酵培養(yǎng)，逐一優(yōu)化初始p H和溫度。

1.2.6 生物量測定方法

按3%的接種量將種子液接入裝量為20 mL NA培養(yǎng)基的100 mL三角搖瓶中，37℃，220 r/min培養(yǎng)10 h。以接種前培養(yǎng)基為空白對照，采用酶標儀測定波長為320 nm處的菌液的OD值。（預實驗：對篩選得到的短小芽孢桿菌的發(fā)酵液進行全波長掃描，在OD320處有最大吸收峰，因此測定采用波長320 nm處的OD值。）

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

由于滲透液中菌株很多，對滲透液進行80℃處理20 min，可以殺死一些不耐高溫的微生物，快速得到芽孢桿菌。菌落形態(tài)分為半透明和不透明兩種狀態(tài)：不透明的為乳白色，圓形，邊緣整齊有規(guī)則，表面濕潤，光滑，菌落向外凸出生長；半透明的菌落，較少存在，乳黃色，濕潤，光學顯微鏡下觀察，菌體為短桿狀，無莢膜，多數(shù)是單獨存在，部分成鏈排列（圖1），革蘭氏反應呈陽性。

圖1 菌株在油鏡下的形態(tài)（×1 000）

在初步鑒定為芽孢桿菌的基礎上，采用特異性PCR分析鑒定。分析特異性PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖（圖2），可以得出該株革蘭氏陽性菌為短小芽孢桿菌。即使PCR反應擴增出了近緣菌種的DNA片段，但其長度也是與短小芽孢桿菌有差別的［20］。因此通過這種方法可以方便、快捷地分析檢測出短小芽孢桿菌，可省略進行16S rRNA基因序列的測序以及數(shù)據(jù)庫比對分析的步驟。

圖2 菌株的PCR擴增產(chǎn)物電泳結果

2.2 短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 影響菌種生長的最佳碳源及濃度

NA培養(yǎng)基作為單因素實驗的基礎培養(yǎng)基，分別以0.25%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、馬鈴薯淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉和玉米淀粉作為基礎培養(yǎng)基的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)10 h后，采用酶標儀，測定菌液的OD320。由圖3可知，短小芽孢桿菌生長的最佳碳源是玉米淀粉，其次是紅薯淀粉，故選用活性最高的玉米淀粉為最佳碳源。

將基礎培養(yǎng)基中的其他成分固定為蛋白胨0.5%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%，最優(yōu)碳源玉米淀粉質量分數(shù)分別固定為0.1%、0.2%、0.4%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，進行發(fā)酵培養(yǎng)，10 h后，采用酶標儀，測定OD320。由圖4可知，玉米淀粉質量分數(shù)為0.1%時，菌體生長量最大，為最佳質量分數(shù)。

圖3 碳源種類對菌種生長的影響

圖4 玉米淀粉濃度對菌種生長的影響

2.2.2 影響菌種生長的最佳氮源及濃度

NA培養(yǎng)基作為單因素實驗的基礎培養(yǎng)基，將0.5%蛋白胨、酵母提取物、KNO3和NH4NO3作為氮源，基礎培養(yǎng)基中的其他成分不變，接種培養(yǎng)10 h后，采用酶標儀，測定OD320。由圖5可知，短小芽孢桿菌對有機氮源的利用能力比無機氮源高。因為有機氮源成分豐富，不僅提供了氮源，還包含有碳源和少量的無機鹽，而無機氮源成分相對單一。酵母提取物作為氮源明顯優(yōu)于其他氮源，因此選用酵母提取物作為最佳氮源。

將基礎培養(yǎng)基中的各組分固定在玉米淀粉0.1%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%，最佳氮源酵母提取物質量分數(shù)分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.5%和2.0%，其他成分不變，進行發(fā)酵培養(yǎng)。10 h后，采用酶標儀，測定OD320。由圖6可知，OD值隨酵母提取物質量分數(shù)的增大先增大后減小。當質量分數(shù)達到1.0%時，OD值最大。因此選取1.0%為最佳酵母提取物的質量分數(shù)。

圖5 氮源種類對菌種生長的影響

圖6 酵母提取物濃度對菌種生長的影響

2.2.3 影響菌種生長的最佳無機鹽及濃度

基礎培養(yǎng)基中的其他成分不變，分別用0.5%的NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4+K2HPO4（1∶1）復合鹽和ZnSO4·7H2O作為基礎培養(yǎng)基中的無機鹽，以不加無機鹽的基礎培養(yǎng)基為空白對照，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，10 h后，采用酶標儀，測定菌液的OD320，結果如圖7所示。圖7顯示，鈉離子、鎂離子對短小芽孢桿菌的生長都有促進作用，鎂離子作用比較明顯，因此選用MgSO4·7H2O為最佳無機鹽。據(jù)報道磷酸鹽和鋅離子可以促進芽孢桿菌的生長，而這項研究表明磷酸鹽和鋅離子對菌體的生長稍微抑制，這可能是因為離子濃度過高的關系。

將培養(yǎng)基中的其他成分固定在玉米淀粉0.1%，酵母提取物1.0%，NaCl 0.5%，小牛浸膏0.3%，MgSO4·7H2O質量分數(shù)分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，進行發(fā)酵培養(yǎng)。10 h后，采用酶標儀，測定OD320。由圖8可知，MgSO4·7H2O的質量分數(shù)為0.3%，菌體的生長量相對于其他濃度的生長量處于較高水平。因此0.3%是MgSO4·7H2O的最優(yōu)質量分數(shù)。

圖7 無機鹽對菌種生長的影響

圖8 MgSO4·7H2O濃度對菌種生長的影響

2.2.4 碳源、氮源和無機鹽的正交優(yōu)化

通過單因素實驗確定了最佳碳源、氮源、無機鹽，分別是玉米淀粉0.1%，酵母提取物1.0%，Mg-SO4·7H2O 0.3%。通過正交實驗尋找培養(yǎng)基中的各組分之間的最佳配比。實驗因素水平編碼及水平設置見表2。采用搖瓶培養(yǎng)條件，正交實驗27個處理組合條件下菌種在發(fā)酵10 h時的OD320見表3，正交方差分析見表4。

由表3可知，最佳組合為A2B2C3，即玉米淀粉0.10%，酵母提取物1.00%，MgSO4·7H2O 0.49%。通過極差分析可知RB＞RA＞RC。各因素影響菌體生長程度從大到小為酵母提取物、玉米淀粉、Mg-SO4·7H2O。由表4可知，玉米淀粉的F=7.915，P=0.112＞0.05，酵母提取物F=32.420，P= 0.030＜0.05，MgSO4·7H2O的F=6.156，P= 0.140＞0.05。表明酵母提取物對菌體生長的影響為顯著差異，玉米淀粉和MgSO4·7H2O為不顯著差異。

表2 正交實驗因素和水平 %

表3 正交實驗指標結果

表4 正交實驗方差分析

由此得到最佳培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉0.10%，酵母提取物1.00%，MgSO4·7H2O 0.49%，小牛浸膏0.30%，NaCl 0.50%。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 初始p H優(yōu)化

短小芽孢桿菌培養(yǎng)過程中的p H難以控制，通過控制發(fā)酵液的初始p H來尋找最適p H。將最佳培養(yǎng)基的初始p H分別調至3、4、5、6、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、9、10、11、12，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 h，采用酶標儀，測菌液的OD320。

由圖9可知，短小芽孢桿菌在初始p H小于5和大于10的時候，生長緩慢。在初始p H在6～9之間，OD值很高，說明短小芽孢桿菌對p H的適應性比較寬，在p H 6～9之間都能很好地生長。初始p H為7.2的時候，菌種生長最好，因此選用7.2為短小芽孢桿菌的最佳初始p H值。

圖9 初始p H對菌種生長的影響

2.3.2 溫度優(yōu)化

溫度也是影響菌體生長的一個重要因素，能夠改變酶的反應速率。溫度升高可以增大酶的反應速率，促進生長代謝，但酶又會因為溫度過高而失去活性。分別選取28、37、40、43、45、47、49℃和50℃作為搖床溫度，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 h，測菌液的OD320。

由圖10可知，短小芽孢桿菌在28～37℃均可良好生長，說明短小芽孢桿菌對溫度的適應性也較寬，37℃時菌體生長最好。高于45℃后，菌體生長緩慢，OD值急劇下降，表明菌體生長的最高臨界溫度為45～50℃。由此可以得出，短小芽孢桿菌生長的最適溫度為37℃。

圖10 發(fā)酵溫度對菌種生長的影響

3 討 論

隨著工業(yè)化進程的推進，科技日益發(fā)達，工業(yè)、農(nóng)業(yè)、日常生活等方方面面都面臨著廢棄物大量排放的問題。廢棄物隨著降雨的沖刷，會造成土壤、水域的污染，導致了飲用水、食物都受到污染，嚴重威脅到我們?nèi)祟惖纳?。隨著人們的環(huán)保意識和健康意識增強，對環(huán)境、食品的安全要求越來越高。環(huán)境污染問題成為當前社會一個嚴重的問題。其中，城市垃圾滲透液的無害化處理一直是待攻克的難題，傳統(tǒng)治理垃圾滲透液的方法是采用化學物理方法來處理污染物，但是會對環(huán)境造成二次污染。近年來，針對不同的污染物采用不用的治理方法，其中微生物方法治理環(huán)境在生物方法中具有明顯的優(yōu)勢，微生物制劑也成為近年來研究的熱點。其核心是獲得高表達的、適應性廣的優(yōu)良菌種，其中短小芽孢桿菌由于繁殖速度快，能產(chǎn)生穩(wěn)定的芽孢，抗逆能力強，成為了越來越受矚目的生防材料之一。

傳統(tǒng)方法分離鑒定微生物，主要是通過選擇性培養(yǎng)微生物，在根據(jù)形態(tài)觀察做出初步鑒定，之后根據(jù)生理生化反應再進行系統(tǒng)的分類和鑒定。這種方法費力耗時，忽略了微生物具有多樣性，且同一物種不同的菌株也可能有差異。對相近種也不能準確鑒定。因此人們利用現(xiàn)代分子生物學方法找到了一種快速鑒定菌種的方法，16S rRNA基因序列分析方法。

16SrRNA基因的結構既具有保守性又具高變異性［21-22］，長度大小適中，既有保守的基因片段，又含有不同菌種間變異的基因片段，因此采用16S rRNA基因序列分析鑒定短小芽孢桿菌。但是由于16SrRNA的進化速度緩慢，非常保守，并不能很好地鑒定出相對近的菌種，因此在采用16SrRNA基因序列分析的同時，要采用一些生理生化反應或者一些其他保守基因序列的分析來補充。比如可以選擇16S～23S rRNA基因序列和一些比較保守的功能基因序列分析。本實驗首先要從垃圾滲透液中分離得到一株抗性強的短小芽孢桿菌，通過對短小芽孢桿菌16SrRNA堿基序列及gyrA、rpoA基因序列的分析，設計出6對特異性引物，通過對被初步鑒定為芽孢桿菌的菌株進行特異性PCR擴增反應，分析其電泳結果圖，進一步從分子水平來鑒定分離得到的菌株是否為短小芽孢桿菌。

短小芽孢桿菌的生長受外部環(huán)境的影響，環(huán)境不適宜生長的情況下，就會由營養(yǎng)細胞轉變?yōu)檠挎?，處于休眠狀態(tài)，不能高效快速生長。碳源、氮源和無機鹽都會影響菌體的生長。因此需要篩選出滿足其生長的最佳碳源、氮源、無機鹽及最優(yōu)生長條件。通過單因素實驗確定了短小芽孢桿菌最佳培養(yǎng)基的成分為：玉米淀粉，酵母提取物，MgSO4·7H2O。利用正交實驗設計優(yōu)化了短小芽孢桿菌的培養(yǎng)基，得到最適培養(yǎng)基為：玉米淀粉0.10%，酵母提取物1.00%，MgSO4·7H2O 0.49%，小牛浸膏0.30%，NaCl 0.50%。并通過單因素實驗法確定了最佳培養(yǎng)條件，溫度37℃，初始p H 7.2。采用最優(yōu)培養(yǎng)基和基礎培養(yǎng)基分別在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 h。測得OD320值由1.44增長為6.93。生長量提高了將近4.8倍。

在今后的研究中，將繼續(xù)優(yōu)化發(fā)酵過程的培養(yǎng)條件，以及對該菌株進行誘變，提高短小芽孢桿菌的產(chǎn)率。

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Research of IsoIation and Identification of BaciIIus PumiIus and Its CuIturing Conditions

KONGGao-fei，JIN Min，ZHU Lian-Lian，LIN Gao-qiang，LIU Xiao-chuan
（Bioengineering Institute，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

To implement harmless biological treatment of municipal waste penetrating fluid，this paper isolates，screens and identifies the specific strain and optimizes its optimal culturing conditions and culture medium components.The bacillus was isolated from waste penetrating fluid in municipal landfills.The target strain was identified through designing specific primers for PCR reaction.The bacterial cell presented rhabditiform and is Gram-positive.It was identified to be bacillus pumilus.Single factor experiment and orthogonal experiment were adopted to optimize the culture medium most suitable for bacterial strain. Optimized culture medium components include：corn starch 0.1%，yeast extract 1.0%，beef extract 0.3%，NaCl 0.5%，and MgSO4·7H2O 0.49%.Under such conditions，the OD320of the strain after 10 h culture rises to 6.93 from 1.44.This lays a foundation for in-depth study and application of the strain.

waste penetrating fluid；bacillus pumilus；identification；optimization of culturing conditions

Q938.1

A

（責任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0467-07

2013-11-11

孔高飛（1988-），女，山西晉城人，碩士研究生，研究方向為微生物環(huán)境生態(tài)學。

劉小川，F(xiàn)-mail：xcliu@zstu.edu.cn