王世兵，孟樹(shù)林，武 虎，馬步云

（浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心；b.新元醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)研究所，杭州310018）

雙基因溶瘤腺病毒聯(lián)合5-FU抑制肺癌細(xì)胞增殖的研究

王世兵a，孟樹(shù)林b，武 虎b，馬步云b

（浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心；b.新元醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)研究所，杭州310018）

研究攜帶TRAIL和Smac的雙基因溶瘤腺病毒（ZD55-TRAIL-IFTD-Smac）聯(lián)合化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）對(duì)肺癌細(xì)胞的體外殺傷作用。通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western Blot檢測(cè)殺傷性基因表達(dá)與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)合應(yīng)用能有效地抑制肺癌細(xì)胞的增殖，并通過(guò)激活Caspase通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，表明，5-FU能夠顯著增強(qiáng)攜帶TRAIL和Smac的雙基因溶瘤腺病毒對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用，為肺癌的臨床應(yīng)用提供了參考。

ZD55-TRAIL-IFTD-Smac；5-FU；肺癌；凋亡

0 引 言

肺癌是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，尤其在城市，其高發(fā)病率與死亡率都居于惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前，肺癌治療仍然以傳統(tǒng)的手術(shù)放療、化療為主，然而其治療后5年生存率僅為15%，隨著人類對(duì)癌癥發(fā)病機(jī)制的深入研究，人們把關(guān)注的目光投向了生物治療［1-2］。中國(guó)科學(xué)院劉新垣院士在提出癌癥靶向基因-病毒治療的策略［3］（cancer targeting gene-virotherapy，CTGVT）后又提出了癌癥的靶向雙基因治療策略［4-5］（Cancer targeting dual gene-virotherapy），其基本理念是利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在基因表達(dá)譜上的差異，人為改造病毒，使病毒能特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制與增殖，最終裂解細(xì)胞，而在正常細(xì)胞中幾乎不復(fù)制，對(duì)正常細(xì)胞安全。同時(shí)以這種腫瘤特異性的病毒為載體，將外源抑癌基因克隆到病毒基因組中，隨著病毒不斷擴(kuò)增，使得抗癌基因得到高表達(dá)，病毒與抑癌基因兩者協(xié)同作用達(dá)到抗腫瘤的作用。

以ZD55-gene系統(tǒng)構(gòu)建的溶瘤腺病毒具有僅特異地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，從而殺死癌細(xì)胞，而不影響正常細(xì)胞的特性。雙基因溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac治療肝癌移植瘤的研究顯示，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac能在體外、體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞的增殖［6］，但治療肺癌的研究未見(jiàn)報(bào)道。5-FU是一種抗腫瘤的化療藥物，抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸（d UMP）甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账幔╠ TMP），從而影響DNA的合成。盡管5-FU單獨(dú)治療并不能顯著改善患者的生存率，然而通過(guò)與溶瘤腺病毒聯(lián)合治療，5-FU通常有不錯(cuò)的協(xié)同治療效果，研究表明ZD55-MnSOD聯(lián)合5-FU具有協(xié)同作用，可以顯著提高對(duì)結(jié)腸癌的療效［7］，5-FU與Addel-F1B55聯(lián)合治療可以減少單獨(dú)治療時(shí)的用藥量，治療效果卻要高于單獨(dú)用藥的療效［8］。Adsh TS與5-FU聯(lián)合治療有效地抑制了DLD-1/ 5FU，KM12C/5FU和N M GC-3/5FU三種耐藥癌細(xì)胞的增殖［9］。5-FU與h TRAIL聯(lián)合治療能顯著提高h(yuǎn) TRAIL誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞的凋亡［10-12］，而且這種協(xié)同作用在一些多藥耐藥細(xì)胞系以及TRAIL耐藥癌細(xì)胞系都有所發(fā)現(xiàn)［13-14］。因此，基因治療和化療聯(lián)合治療可以作為癌癥治療的新思路。

TRAIL基因?qū)儆赥NF超家族，由于其具有特異性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡且不影響正常細(xì)胞的特性而備受青睞。TRAIL基因主要通過(guò)結(jié)合于腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體，促使依賴于線粒體信號(hào)途徑的細(xì)胞凋亡［15-16］。盡管TRAIL可通過(guò)與死亡受體DR4或DR5特異地結(jié)合并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［17-18］，然而許多癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡高度鈍化［19-21］。Smac基因可以通過(guò)Cytochrome c/ Apaf-1/Caspase-9信號(hào)通路，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要通過(guò)抑制IAPs，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［22］。Smac過(guò)表達(dá)可以有效增加細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性［23-24］；因此，筆者聯(lián)合雙基因溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU體外作用于肺癌細(xì)胞，其效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于基因治療或化療分別單獨(dú)作用肺癌細(xì)胞時(shí)的效果。本研究主要探討了ZD55-TRAILIFTD-Smac聯(lián)合5-FU對(duì)于肺癌細(xì)胞增殖的抑制以及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞株H1299、NCI-H460和A549由本實(shí)驗(yàn)室保存，細(xì)胞均培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%FBS的DMFM（Dulbeccos modified Fagle medium），DMFM購(gòu)自杭州吉諾生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)BS購(gòu)自GIBCO公司；MTT染料購(gòu)自Sigma公司；Caspase-3，Caspase-8抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；TRAIL、Smac、F1A、poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）和GAPDH抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司；BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司；IRDye?680Donkey Anti-Goat IgG，IRDye? 680 Donkey Anti-Mouse IgG，IRDye?800 Donkey Anti-Rabbit IgG均購(gòu)自LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT染色檢測(cè)細(xì)胞增殖

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，收集細(xì)胞，用含5%FBS的DMFM重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋至需要的密度，以每孔100μL接種于96孔板中，使細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔。5%CO2、37℃培養(yǎng)12 h分別在相應(yīng)孔中加病毒ZD55-TRAIL-IFTDSmac，5-FU，病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac+5-FU，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別設(shè)5個(gè)復(fù)孔。孵育72 h后，每孔加入20μL MTT溶液（5 g/L，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)配養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔的OD490 nm吸光值，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔。細(xì)胞生存率=（處理組吸光值-調(diào)零孔吸光值）/（對(duì)照孔吸光值-調(diào)零孔吸光值）×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

在6孔板中以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞，37℃、5%CO2貼壁培養(yǎng)12 h后，在處理組細(xì)胞中分別加入0.8μg/mL 5-FU，4MOI病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，0.8μg/mL 5-FU+4MOI病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，對(duì)照組中加入相同體積的PBS，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，按細(xì)胞傳代方法收集細(xì)胞，參照AnnexinⅤ/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明，用預(yù)冷的PBS洗滌收集的細(xì)胞2遍，然后用100μL的1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每孔中分別加入5μL的1×Annexin-Ⅴ和5μL的1×PI，室溫下避光搖床上低速孵育15 min后，加入400μL 1×結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀分析。

1.2.3 Western blot檢測(cè)目的基因及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)

將5×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，37℃、5% CO2貼壁培養(yǎng)12 h后，在處理組細(xì)胞中分別加入0.8μg/mL 5-FU，4MOI病毒ZD55-TRAIL-IFTDSmac，0.8μg/mL 5-FU+4MOI病毒ZD55-TRAILIFTD-Smac，設(shè)立加入等量PBS為對(duì)照組，37℃、5% CO2，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按Western blot操作裂解細(xì)胞收集上清總蛋白。按Thermo Fisher公司BCA蛋白定量試劑盒操作說(shuō)明定量收集的蛋白濃度。將定量蛋白以每孔加入10μg總蛋白樣加入SDSPAGF電泳，電泳結(jié)束后按半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜（NC膜），5%的脫脂奶粉中封閉2 h，一抗孵育，按抗體說(shuō)明書上的最佳稀釋濃度稀釋加一抗（1∶1 000稀釋），室溫下于搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入稀釋好的熒光二抗（1∶15 000稀釋），室溫下?lián)u床孵育45～60 min，TBST洗膜3次，每次10 min，用LI-COR掃膜儀掃膜，紅外激光成像系統(tǒng)對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，全部結(jié)果用（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié) 果

2.1 MTT分析檢測(cè)5-FU與病毒聯(lián)用對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用

本實(shí)驗(yàn)分別利用目的病毒ZD55-TRAILIFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理H1299、NCI-H460和A549肺癌細(xì)胞。細(xì)胞處理分別設(shè)ZD55-TRAIL-IFTD-Smac 1、2、4、8 MOI的4個(gè)梯度，設(shè)5-FU 0.2、0.4、0.8、1.6 μg/mL的4個(gè)梯度。如圖1所示，ZD55-TRAILIFTD-Smac單獨(dú)處理H1299，NCI-H460和A549肺癌細(xì)胞時(shí)，其抑制率分別為1.4%～37.1%，5.4%～47.9%，6.9%～47.9%。5-FU單獨(dú)處理H1299，NCI-H460和A549肺癌細(xì)胞時(shí)，其抑制率分別為6.6%～46.8%，5.1%～44.5%，3.6%～44.9%。ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用其抑制率分別達(dá)到17.9%～74.8%，19.7%～71.3%，17.1%～75.5%。從圖2上可以看出，二者的聯(lián)用有效地抑制了肺癌細(xì)胞的增殖，聯(lián)用的作用效果不是簡(jiǎn)單地二者單獨(dú)作用效果的疊加，二者具有一定的協(xié)同作用。

圖1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAILIFTD-Smac與5-FU聯(lián)用分別處理H1299，NCIH460肺癌細(xì)胞，處理劑量分別為4MOI，0.8μg/ mL，4MOI+0.8μg/mL，設(shè)立加等量PBS的對(duì)照組，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，AnnexinⅤ/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。如圖2在Q4區(qū)AnnexinⅤ高陽(yáng)性，PI低陽(yáng)性的區(qū)域?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照組，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAIL-IFTDSmac與5-FU聯(lián)用分別處理H1299，NCI-H460細(xì)胞，H1299細(xì)胞早期凋亡率依次為2.2%、2.7%、9.5%、22.2%；NCI-H460細(xì)胞早期凋亡率依次為2.9%、2.8%、6.4%、27.1%。說(shuō)明ZD55-TRAILIFTD-Smac與5-FU聯(lián)用起到了很好地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。

2.3 Western blot檢測(cè)抑癌基因及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAILIFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理NCI-H460細(xì)胞，劑量為4MOI+0.8μg/m L，設(shè)立加等量PBS的對(duì)照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，Western blot檢測(cè)目的基因TRAIL、Smac的表達(dá)及凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果如圖3，在ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理A549細(xì)胞中，TRAIL和Smac都有很高的表達(dá)。在未處理組，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理組中凋亡相關(guān)蛋白caspase-8的前體及激活的Caspase-8表達(dá)量都有顯著升高。同時(shí)我們檢測(cè)到相應(yīng)組細(xì)胞中Caspase-3及其活化形式呈現(xiàn)顯著變化，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理組細(xì)胞Caspase-3活化的增強(qiáng)，繼而剪切凋亡底物PARP相應(yīng)增加，圖4進(jìn)一步有力地說(shuō)明了ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用可以有效地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。

圖3 Western blot檢測(cè)目的基因的表達(dá)

圖4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

筆者成功地進(jìn)行了溶瘤腺病毒ZD55-TRAILIFTD-Smac聯(lián)合5-FU抗癌藥物抑制肺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的體外研究。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac聯(lián)合5-FU在處理劑量為8MOI+1.6μg/mL時(shí)效果最為明顯，其對(duì)H1299、NCI-H460和A549細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到了74.8%、71.3%、75.5%，表明二者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞的抑制效果明顯強(qiáng)于ZD55-TRAIL-IFTD-Smac和5-FU分別單獨(dú)對(duì)細(xì)胞的抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)用來(lái)檢測(cè)ZD55-TRAIL-IFTD-Smac聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二者聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)強(qiáng)有力地誘導(dǎo)了肺癌細(xì)胞的凋亡，其在處理H1299和NCI-H460兩種癌細(xì)胞系時(shí)都有很好地體現(xiàn)，二者在處理劑量為4MOI+0.8μg/m L，時(shí)間為48 h時(shí)，誘導(dǎo)H1299，NCI-H460細(xì)胞凋亡率分別達(dá)到了22.2%、27.1%。有研究表明ZD55-Smac與5-FU聯(lián)用能起到強(qiáng)有力的協(xié)同效果［22］，這一點(diǎn)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用連接子IFTD連接的TRAIL和Smac兩段抑癌基因得到了很好地表達(dá)，而且其在細(xì)胞中能被正確的切割，同時(shí)起到了協(xié)同抑制肺癌細(xì)胞的作用。ZD55-TRAIL-IFTD-Smac聯(lián)合5-FU有效地刺激了胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8和PARP的表達(dá)與激活，最終使肺癌細(xì)胞凋亡［23］。

如何提高溶瘤腺病毒的靶向性及安全性是溶瘤腺病毒治療癌癥走向臨床首要解決的問(wèn)題。目前主要通過(guò)以下幾點(diǎn)對(duì)溶瘤腺病毒進(jìn)行改造［25-26］：a）在溶瘤腺病毒的纖維蛋白結(jié)節(jié)上插入外源多肽，使得溶瘤腺病毒能特異的靶向某一類高表達(dá)特異抗原決定簇的癌細(xì)胞；b）通過(guò)嵌合修飾使溶瘤腺病毒能特異靶向于癌細(xì)胞表面的多個(gè)靶點(diǎn)；c）通過(guò)融合表達(dá)融合蛋白在一些缺少腺病毒結(jié)合受體（CAR）的癌細(xì)胞與溶瘤腺病毒之間架起橋梁，使一些難于被溶瘤腺病毒侵染的癌癥得到治療；d）利用癌癥組織特異性啟動(dòng)子控制溶瘤腺病毒復(fù)制所需早期基因，使得溶瘤腺病毒僅在表達(dá)特異蛋白的癌細(xì)胞里大量復(fù)制、增殖，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。

伴隨著分子生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，免疫學(xué)，生物信息學(xué)的發(fā)展，可以篩選更為有效地目的基因作為溶瘤腺病毒攻克癌癥的利器。一些植物凝集素，海洋肽內(nèi)毒素，以及中草藥中有用的抗癌成分可裝載在溶瘤腺病毒上進(jìn)行表達(dá)，使溶瘤腺病毒成為惡性腫瘤基因治療的有效載體。

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WANG Shi-bing1，2，MENGShu-Lin1，WU Hu1，MA Bu-yun1

（a.Scientific Research Fxperiment Center，College of Life Science；b.Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Study on Inhibition of Lung Cancer CeII ProIiferation by Combination of DuaI-Gene OncoIytic Adenovirus with 5-FU

The study explores the in-vitro lethal effects of dual-gene oncolytic adenovirus（ZD55-TRAIL-IFTD-Smac）with TRAIL and Smac in combination of 5-FU on lung cancer cells.Cell inhibition ratio，apoptosis rate，destruction gene expression&apoptosis-related protein expression were detected by MTT，flow cytometry and Western Blot respectively.The results show that combined application of ZD55-TRAIL-IFTD-Smac and 5-FU can effectively inhibit the proliferation of lung cancer cells and induce apoptosis of lung cancer cells through activating Caspase passage.This indicates that 5-FU can significantly enhance lethal effects of dual-gene oncolytic adenovirus with TRAIL and Smac on lung cancer cells.This provides reference for clinical application of lung cancer.

ZD55-TRAIL-IFTD-Smac；5-FU；lung cancer；apoptosis

Q789

A

（責(zé)任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0445-06

2013-10-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（51272236，51002139）；浙江省自然科學(xué)基金（LY13H080005）；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014C37101）

王世兵（1986-），男，安徽宣城人，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閻盒阅[瘤的生物治療。