許韶威，劉冰穎，周 煒，高 永，楊支力，呂正兵，徐 濤

（浙江理工大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所；b.啟新學(xué)院；c.生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究所，杭州310018）

三葉半夏凝集素C端結(jié)構(gòu)域的可溶表達(dá)及其活性研究

許韶威a，劉冰穎b，周 煒a，高 永a，楊支力a，呂正兵c，徐 濤b

（浙江理工大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所；b.啟新學(xué)院；c.生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究所，杭州310018）

利用pFT-32-SUMO表達(dá)載體在大腸桿菌中可溶表達(dá)三葉半夏凝集素C端結(jié)構(gòu)域（P-D2），并研究其凝血活性、糖結(jié)合特異性以及腫瘤抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P-D2蛋白的產(chǎn)量為5 mg/L。該蛋白具有凝集小鼠紅細(xì)胞的活性，可以被D-甘露聚糖抑制，但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖抑制。P-D2蛋白的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7404以及結(jié)腸癌細(xì)胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡現(xiàn)象觀察實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P-D2蛋白可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞Bel-7404的凋亡。這是首次在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了可溶的半夏凝集素C端結(jié)構(gòu)域，為其他凝集素的可溶表達(dá)提供了新的選擇。

P-D2；凝血活性；SUMO；Hochest染色；抗腫瘤活性

0 引 言

凝集素是一類廣泛存在于動(dòng)植物中，可以特異性結(jié)合糖基的非免疫來(lái)源的糖蛋白或者蛋白［1-3］。凝集素這種糖結(jié)合特異性的能力，不僅賦予了凝集素凝血［1］、抗腫瘤［3］、殺蟲等生理特性，也使得其在現(xiàn)代生物研究中有很多的應(yīng)用。如探索癌變過(guò)程中癌細(xì)胞表面的糖蛋白變化［4］，或者與一些生物素、熒光素、納米顆粒等結(jié)合，可用于電鏡或光鏡水平的免疫細(xì)胞學(xué)研究［5］等。半夏凝集素（PTA）是從中藥半夏塊莖中分離得到的一種活性蛋白［6］，可以凝集兔血細(xì)胞、鼠血細(xì)胞，但不能凝集人血細(xì)胞［7］，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞如卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌等都有比較好的抑制效果，是一類發(fā)展前景比較好的潛在抗腫瘤藥物。在以往的凝集素表達(dá)研究中，研究者選用了原核表達(dá)系統(tǒng)以及家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了半夏凝集素［2，8］，但仍存在表達(dá)產(chǎn)物為包涵體、純化不易、表達(dá)周期過(guò)長(zhǎng)、不適宜工業(yè)化生產(chǎn)等問(wèn)題。

SUMO（small ubiquitin related modifier，小泛素相關(guān)修飾物）是一類廣泛的存在各種真核細(xì)胞中的小分子泛素樣修飾蛋白，在調(diào)節(jié)如RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白的核質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生理活動(dòng)中起著重要作用［9］。有報(bào)道指出，一些難表達(dá)的蛋白可通過(guò)使用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)［10］。SUMO能增加重組蛋白溶解性，促進(jìn)其正確折疊［11］，且SUMO蛋白酶可以高效無(wú)損切開融合蛋白，并不影響表達(dá)的蛋白的活性。這使得SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)在蛋白表達(dá)領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

半夏凝集素是由兩個(gè)相同的N端結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)相同的C端結(jié)構(gòu)域組成的同源二聚體［7］。本研究首次采用人源SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了可溶的三葉半夏凝集素C端結(jié)構(gòu)域（P-D2）。這是首次表達(dá)獲得了可溶的三葉半夏凝集素C端結(jié)構(gòu)域。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PCR所需的試劑（Taq聚合酶、MgCl2、10× buffer、DNTP）、SanPrep柱式系列試劑盒（PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒）、限制性內(nèi)切酶（Bam HⅠ和NotⅠ）、IPTG、酵母提取物、蛋白胨、SDS-PAGF所需試劑、Ni-NTA Sefinose TM Resin等均購(gòu)自上海生工。p Fasy T1-pta質(zhì)粒存儲(chǔ)于浙江理工大學(xué)生物工程研究所。質(zhì)粒p FT-32-SUMO以及SUMO蛋白酶由浙江理工大學(xué)生物化學(xué)研究所王濤惠贈(zèng)。其他所需未提及的試劑和耗材均購(gòu)自杭州蘭堡生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 融合蛋白表達(dá)載體p FT-32-SUMO-D2的

構(gòu)建與鑒定

以質(zhì)粒p Fasy T1-pta（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，半夏凝集素的序列保存于內(nèi)）為模版，以P1、P2（表1）為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定無(wú)誤后，割膠回收。回收產(chǎn)物以及質(zhì)粒p FT-32-SUMO分別用Bam HⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，同樣經(jīng)凝膠電泳鑒定無(wú)誤后，割膠回收酶切片段，進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表1 三葉半夏凝集C端結(jié)構(gòu)域基因序列引物序列

1.2.2 SUMO-D2融合蛋白的表達(dá)以及純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒p FT-32-SUMO-D2轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21（DF3），挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。以1%（V/V）的接種量接種到含氨芐青霉素（100μg/mL）LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6 h后，以1∶1 000（V/V）添加誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度為28℃，12 h后分別取誘導(dǎo)以及未誘導(dǎo)菌體進(jìn)行超聲破碎，離心取上清過(guò)鎳柱純化。

1.2.3 SUMO-D2融合蛋白的酶切以及純化

利用SUMO蛋白上有His標(biāo)簽，而目標(biāo)蛋白上沒有標(biāo)簽，因此可以通過(guò)鎳柱進(jìn)行分離純化。收集得到的融合蛋白經(jīng)BCA測(cè)定濃度后，加入適量的SUMO蛋白酶（按0.1%的m/m加入）?；靹蚝螅尤氲酵肝龃?，4℃過(guò)夜透析，透析緩沖液為PBS。透析完畢后，取透析袋里的液體進(jìn)行Ni-NTA柱親和層析，直接收集上樣后的流出液。流出液用超濾管進(jìn)行濃縮，濃縮到目標(biāo)濃度后，-80℃凍存直至使用。

1.2.4 P-D2蛋白凝血活性實(shí)驗(yàn)以及糖結(jié)合特異性實(shí)驗(yàn)

凝血活性實(shí)驗(yàn)參照Luo［12］所示的方法。終濃度為2、4、6、8、10μg/mL P-D2蛋白溶液分別與適量的準(zhǔn)備好的小鼠紅細(xì)胞混勻，靜置1 h后，在倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照組則加入等量的PBS。

糖結(jié)合特異性實(shí)驗(yàn)參照Z(yǔ)hou［7］所示的方法。選用的糖類為D-甘露聚糖、D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖。

1.2.5 P-D2蛋白的體外抗腫瘤活性

體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)參照黃越［13］所示的方法。采用MTT法，選用的腫瘤細(xì)胞系為Bel-7404和SW-620。采用梯度稀釋在超凈臺(tái)內(nèi)獲得一系列無(wú)菌梯度濃度的P-D2溶液，濃度分別為800、400、200、100、50μg/mL，稀釋的Buffer（50 mM NaCl，50 mM Tris）同樣過(guò)濾除菌。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，每孔加入80μL細(xì)胞。接著5%CO2，37℃孵育。至細(xì)胞單層鋪滿孔底，每孔加20μL加入P-D2蛋白溶液，5個(gè)梯度，5個(gè)復(fù)孔。接著孵育48 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。之后每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心去掉培養(yǎng)液，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，倒扣晾干。每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀495 nm處測(cè)量各孔的吸光值（OD495）。

1.2.6 Hochest 33342染色觀察腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象觀察實(shí)驗(yàn)參照Z(yǔ)hou［7］所示的方法。選用肝癌細(xì)胞為Bel-7404，熒光染料為Hochest 33342。經(jīng)P-D2蛋白處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1μL Hochest 33342溶液（1 mg/ mL），繼續(xù)培養(yǎng)1 h。去掉培養(yǎng)液后，在倒置熒光顯微鏡下，觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 SUMO-D2融合蛋白表達(dá)以及分離純化

融合蛋白N端帶有6×His標(biāo)簽用于鎳柱純化。純化圖如圖1所示。箭頭所指的即為SUMOD2融合蛋白。所有樣品都是超聲破碎后離心所得。圖1中箭頭所指的就是SUMO-D2蛋白，大小為32 kD。從圖中可得，該純化步驟所得的SUMO-D2的純度在95%以上。

圖1 SUMO-D2融合蛋白鎳柱純化

2.2 SUMO-D2融合蛋白酶切以及P-D2分離純化

因?yàn)镾UMO蛋白N端帶有His標(biāo)簽，而P-D2沒有帶His標(biāo)簽，故上樣過(guò)鎳柱時(shí)，SUMO蛋白以及未被切開的SUMO-D2融合蛋白都會(huì)結(jié)合在柱子上，而P-D2則可以順利地流下來(lái)，收集上樣流下液即可以獲得P-D2蛋白，最后純化得到的P-D2蛋白產(chǎn)量為5 mg/L。盡管SUMO分子質(zhì)量只有10 kD，但在SDS-PAGF電泳時(shí)大小為20 kD左右［14-15］。這與圖2中孔道2箭頭所示的相符。P-D2蛋白大小為12 kD左右，也與圖中箭頭指出的相符。

圖2 P-D2蛋白鎳柱純化

2.3 蛋白凝血活性實(shí)驗(yàn)以及糖結(jié)合特異性實(shí)驗(yàn)

過(guò)濾除菌的P-D2蛋白經(jīng)梯度稀釋法稀釋出一系列濃度梯度，加樣到預(yù)先準(zhǔn)備在96孔板中的血細(xì)胞中，倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而獲得最小凝集血細(xì)胞的濃度，如圖3所示。圖3A為對(duì)照組（PBS處理），B為實(shí)驗(yàn)組（6μg/m L P-D2處理）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)P-D2的濃度降到6μg/mL時(shí)，可以觀察到一定的凝集效果。

糖結(jié)合特異性實(shí)驗(yàn)是建立在凝血實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的。當(dāng)凝集素和特定的一些單糖或者多糖結(jié)合后，就觀察不到凝血現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P-D2蛋白可以和D-甘露聚糖結(jié)合反應(yīng)，觀察到最低的結(jié)合濃度為（0.63±0.05）mM/L，而D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖濃度增加到300 m M/L也能觀察到血凝現(xiàn)象，說(shuō)明D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖不和P-D2反應(yīng)。

2.4 P-D2蛋白體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)中，P-D2蛋白的終濃度呈遞增梯度（10、20、40、80、160μg/mL），處理時(shí)間為48 h，未加樣處理過(guò)的癌細(xì)胞被設(shè)置為對(duì)照，即為存活100%的。結(jié)果顯示（圖4），P-D2對(duì)這兩種細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的抑制其增殖的效果，對(duì)兩者的抑制趨勢(shì)也是相同的。存活曲線同樣也表明P-D2對(duì)這種兩種癌細(xì)胞的抑制效果具有濃度依賴性，即在一定濃度范圍內(nèi)，隨著加樣濃度的增加，抑制效果也同樣增加。其中P-D2蛋白對(duì)肝癌Bel-7404的抑制效果明顯優(yōu)于對(duì)結(jié)腸癌SW620（P＜0.05）。

圖4 P-D2蛋白體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

2.5 Hochest 33342染色觀察腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

P-D2蛋白的終濃度呈遞增梯度（10、20、40、80、160μg/mL），處理時(shí)間為24 h和48 h，對(duì)照組PBS處理。加樣處理48 h后，在加熒光染料觀察前，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，結(jié)果（圖5）顯示，P-D2蛋白處理過(guò)的細(xì)胞，出現(xiàn)明顯的變圓收縮，且隨著蛋白濃度的增加，作用效果更明顯。這表明了P-D2蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7404的抑制效果具有濃度依賴性。

圖5 Bel-7404細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變

典型的凋亡特征是形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)染色質(zhì)聚集，呈月牙狀，細(xì)胞皺縮，胞漿致密，直至出現(xiàn)凋亡小體。從形態(tài)學(xué)上看，Hochest 33342染色下，正常的細(xì)胞淡藍(lán)色呈圓形，內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒。而凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)亮藍(lán)色，或者核呈分葉狀、邊集、碎片狀。如圖6所示，處理時(shí)間為24 h的細(xì)胞，大多數(shù)剛開始出現(xiàn)凋亡，即處在凋亡早期。隨濃度升高，部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡中后期的特征。處理時(shí)間為48 h的細(xì)胞，在較低濃度下，部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡中后期的特征，隨濃度升高，處在凋亡晚期的細(xì)胞也越多，同時(shí)細(xì)胞密度也越低。而對(duì)照組正常，說(shuō)明了P-D2誘導(dǎo)了Bel-7404細(xì)胞的凋亡。

圖6 Bel-7404細(xì)胞核染實(shí)驗(yàn)

2.6 討論

盡管已經(jīng)從植物、無(wú)脊椎動(dòng)物中提取了成千上百種的凝集素，用于研究其生物學(xué)上的性狀或者生物學(xué)上的應(yīng)用［3，16］，但很少有研究凝集素的工程菌表達(dá)。潛在的原因是，凝集素的表達(dá)仍是一個(gè)難點(diǎn)或者天然的凝集素獲取更加經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便。孫素榮等［7］的研究就發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的新疆黃精凝集素序列才能在酵母表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)。半夏凝集素作為甘露聚糖凝集素家族的一份子，對(duì)眾多的腫瘤細(xì)胞有較好的抑制增殖的作用以及在研究甘露聚糖受體有一定貢獻(xiàn)。迄今為止，半夏凝集素已經(jīng)在原核表達(dá)系統(tǒng)以及家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)里成功表達(dá)出來(lái)［2，8］，但仍存在表達(dá)后是包涵體或者是表達(dá)周期過(guò)長(zhǎng)、純化不易等諸多難以解決的問(wèn)題。本研究首次利用SUMO融合系統(tǒng)成功地表達(dá)了可溶的半夏凝集素C端結(jié)構(gòu)域蛋白，即P-D2蛋白，解決了以往半夏凝集素表達(dá)不可溶的問(wèn)題。

凝血特性是凝集素蛋白的本質(zhì)特性。不同的凝集素所能凝結(jié)的紅細(xì)胞類型也不一樣。而能凝集人紅細(xì)胞的凝集素相對(duì)更少，將近十分之一的豆科凝集素可以專一地凝集人的某一種紅細(xì)胞。利馬豆和野豌豆的簇絨的提取物，只能凝集人A型紅細(xì)胞，而不能凝集B型或者O型的。豆科灌木植物加納谷物的提取物，更專一的凝集B型。凝集素之所以可以凝集紅細(xì)胞，是因?yàn)槟乜梢院图?xì)胞表面的一些糖蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合。這也使得凝集素不僅僅可以凝集紅細(xì)胞，對(duì)淋巴細(xì)胞、某些細(xì)菌以及真菌同樣有沉降效果［1］。半夏凝集素對(duì)兔血，小鼠血都有比較好的凝集效果，但對(duì)人血沒有凝集效果。在P-D2蛋白凝血活性研究中，P-D2蛋白在較低的濃度（6μg/mL）對(duì)小鼠紅細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的凝集效果。凝集素這種糖結(jié)合特異性的特點(diǎn)，在P-D2蛋白糖結(jié)合特異性實(shí)驗(yàn)中也得到體現(xiàn)。P-D2蛋白可以和D-甘露聚糖發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，觀察到最低的結(jié)合濃度為（0.63±0.05）mM/L，而D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖未能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。

大量研究表明凝集素對(duì)各類腫瘤細(xì)胞都有較好的抗腫瘤活性［18］。其原因在于凝集素可以特異性地結(jié)合某些癌癥細(xì)胞表面的糖類，干擾其正常生長(zhǎng)。這使得同種凝集對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞作用效果也不同。P-D2蛋白抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)中表明，P-D2蛋白對(duì)著Bel-7404以及SW620這兩種癌細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的抑制其增殖的效果，其抑制效果具有濃度依賴性。但對(duì)Bel-7404癌細(xì)胞的作用效果優(yōu)于SW620細(xì)胞。其原因是這兩種癌細(xì)胞表面的糖蛋白種類不同，而P-D2蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖的原因可能是其與癌細(xì)胞表面的糖蛋白發(fā)生反應(yīng)，從而中斷癌細(xì)胞增殖的某些信號(hào)通路。核染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，P-D2蛋白可以引起B(yǎng)el-7404細(xì)胞的凋亡。凋亡程度呈現(xiàn)時(shí)間依賴和濃度依賴。目前的研究表明凝集素所引起的凋亡機(jī)制可分為兩種，一種是當(dāng)凝集素與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，可激活caspase途徑，如蒙大拿鐵線蓮凝集素可激活caspase途徑，從而誘導(dǎo)HepG2和HeLa等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［19］，另一種是通過(guò)內(nèi)吞作用激活線粒體途徑從而誘發(fā)凋亡［5］，如伴刀豆凝集素可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞（PU5-1.8）中的線粒體的聚集和細(xì)胞色素C的釋放從而誘導(dǎo)凋亡［19］。但半夏凝集素引發(fā)凋亡的機(jī)制尚未得到研究，其引發(fā)凋亡的分子機(jī)制需要進(jìn)一步的研究才能確定。

3 結(jié) 論

采用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了可溶并有活性的三葉半夏凝集素C端結(jié)構(gòu)域，即P-D2蛋白。P-D2蛋白產(chǎn)量為5 mg/L。凝血活性實(shí)驗(yàn)表明P-D2的濃度降到6μg/mL時(shí)，可以觀察到明顯的凝集效果。糖結(jié)合特異性實(shí)驗(yàn)表明P-D2蛋白可以和D-甘露聚糖結(jié)合反應(yīng)，觀察到最低的結(jié)合濃度為（0.63±0.05）mM/L，而D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖濃度增加到300 m M/L也不能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。P-D2蛋白對(duì)Bel-7404以及SW620這兩種癌細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的抑制其增殖的效果，其抑制效果具有濃度依賴性。核染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，P-D2蛋白可以引起B(yǎng)el-7404細(xì)胞的凋亡，凋亡程度隨蛋白作用時(shí)間和濃度的增加而增加。

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Study on SoIubIe Expression and Bioactivity of C-Terminus Domain of PineIIia Ternata AggIutinin

XUShao-weia，LIU Bing-yingb，ZHOU Weia，GAOYonga，YANG Zhi-Lia，LüZheng-bingc，XU Taoa
（a.Biological Fngineering Research Institute，b.Qixin College，c.Biological Chemistry Research Institute，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

p FT-32-SUMO expression vector was used for soluble expression of C-terminus domain of pinellia ternata agglutinin（P-D2）and study on hemagglutination activity，saccharides binding specificity and tumor-inhibition activity.The results show that，the output of P-D2 protein is 5 mg/L.This protein has the activity to agglutinate erythrocyte of the mice and can be inhibited by D-mannan but not by D-lactose，D-glucose and D-maltose.The experiment of antitumor activity in vitro of P-D2 protein indicates it has good inhibiting effect on hepatoma carcinoma cell Bel-7404 and colon cancer cell SW-620.It is found through observation of apoptosis phenomenon that P-D2 can induce apoptosis of Bel-7404.Soluble C-terminus domain of pinellia ternata agglutinin is expressed in escherichia coli expression system the first time. This provides new choice for soluble expression of other agglutinin.

P-D2；hemagglutination activity；SUMO；hochest dyeing；antitumor activity

Q816

A

（責(zé)任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0439-06

2013-12-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30772712），大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201310338122）

許韶威（1988-），男，浙江衢州人，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。

徐 濤，電子郵箱：pkuxt@aliyun.com