郭俊元,信 欣,能子禮超,李劍鋒 (成都信息工程學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院,四川 成都 610225)

微生物絮凝劑,由微生物代謝活動(dòng)產(chǎn)生的具有絮凝活性的有機(jī)物質(zhì),以其環(huán)境友好和易降解的特點(diǎn),成為環(huán)境治理領(lǐng)域的中堅(jiān)力量[1-2].將有機(jī)物和氮磷含量豐富的廢水或廢棄物作為原材料生產(chǎn)微生物絮凝劑,一方面可以降低生產(chǎn)成本,另一方面可以實(shí)現(xiàn)廢水和廢棄物的資源化利用.豬場(chǎng)糞污是我國(guó)規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖業(yè)的主要污染來源,豬場(chǎng)廢水中含有大量的有機(jī)物和氮磷,可為微生物的生長(zhǎng)和代謝提供豐富的碳源、氮源和磷源[3-4].因此,利用豬場(chǎng)廢水生產(chǎn)微生物絮凝劑能夠降低生產(chǎn)成本,并實(shí)現(xiàn)資源化.邱國(guó)良等[5]通過向厭氧處理后的豬場(chǎng)廢水附加一定量的碳源和磷酸鹽生產(chǎn)微生物絮凝劑,考察了其絮凝性能[5].發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究微生物發(fā)酵過程中其生長(zhǎng)和代謝之間相互關(guān)系的科學(xué),目前多用經(jīng)驗(yàn)公式描述絮凝菌生長(zhǎng)和產(chǎn)絮過程,鮮有建立菌體濃度、代謝產(chǎn)物濃度、pH值、溶解氧等工藝參數(shù)的控制方案[6-8].

試驗(yàn)采用豬場(chǎng)廢水生產(chǎn)微生物絮凝劑,考察絮凝菌發(fā)酵過程中菌體濃度、代謝產(chǎn)物濃度、基質(zhì)濃度、溶解氧、氨氮、總磷及pH值的變化規(guī)律,利用 Logistic和 Luedeking-Piret模型對(duì)絮凝菌生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物生成的動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行擬合,以期為菌株發(fā)酵過程的優(yōu)化提供先決條件,為提高經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑配制 CaCl2(分析純,天津恒興化學(xué)試劑制造公司),配制 10g/L的溶液.高嶺土(分析純,天津恒興化學(xué)試劑制造公司),配制 4g/L的懸濁液.NaOH和HCl(分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠)均配制1mol/L的溶液.

1.1.2 微生物菌株和微生物絮凝劑 試驗(yàn)所用菌株為紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis),保藏于中國(guó)典型微生物保藏中心,保藏號(hào)為ACCC.10543.微生物絮凝劑是菌株利用豬場(chǎng)廢水發(fā)酵制備的,豬場(chǎng)廢水中 COD和氨氮含量分別為1350,1283mg/L,廢水pH值為7.6.微生物絮凝劑的制備包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng).種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10,酵母粉 5,牛肉膏 2,NaCl 10,pH=7.0.挑取少許菌至 150mL種子培養(yǎng)基中,于發(fā)酵溫度30℃,搖床速度120r/min下培養(yǎng)得種子液.將種子液以2%(V/V)的接種量接種至121℃滅菌處理 30min的豬場(chǎng)廢水中(150mL),于發(fā)酵溫度 35℃,搖床速度 150r/min下發(fā)酵得到發(fā)酵液,采用丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇)從發(fā)酵液中提取絮凝劑.所得絮凝劑為蛋白質(zhì)類物質(zhì),紅外光譜圖顯示,絮凝劑中含有羥基,羧基以及含硫基團(tuán),其中 3430cm-1處的峰是—OH,1640cm-1處的峰為COO-的反對(duì)稱伸縮振動(dòng),1544cm-1是COO-的對(duì)稱伸縮振動(dòng),1620cm-1和 1082cm-1處的峰是CO[9-13].

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定 試驗(yàn)采用比濁法測(cè)定菌體細(xì)胞密度,試驗(yàn)過程中,以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基(采用相同的手段進(jìn)行滅菌和發(fā)酵培養(yǎng))作為對(duì)照組,對(duì)不同發(fā)酵階段的發(fā)酵液,使用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600nm處的OD值,可以反應(yīng)本文絮凝菌的細(xì)胞數(shù)量.

1.2.2 絮凝率的測(cè)定 1.0L高嶺土懸液(4g/L)中加入5mL CaCl2溶液作為助凝劑,再加入2mL離心去菌體后的發(fā)酵液,常溫條件下,快速攪拌1.0min (180r/min),慢速攪拌 4.0min (80r/min),靜置 10min,取上清液,使用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)550nm處的OD值(OD550),同時(shí)以2mL未接種的培養(yǎng)基作對(duì)照.計(jì)算公式如下:

式中: FR為絮凝率;A為絮凝后高嶺土懸液的OD550;B為高嶺土原懸濁液的OD550.

1.2.3 發(fā)酵動(dòng)力學(xué) Logistic動(dòng)力學(xué)方程能很好地反應(yīng)菌株生長(zhǎng)過程中因菌體濃度的增加對(duì)自身生長(zhǎng)的抑制作用,因此常用來表述菌株生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過程[14-15].Logistic方程如下:

式中:X(t)為菌株濃度,g/L;X0為發(fā)酵初始菌株濃度,g/L;Xm為最大菌株濃度,g/L;t為發(fā)酵時(shí)間,h;μm為最大比生長(zhǎng)速率,h-1.

Luedeking-Piret方程描述發(fā)酵過程中菌株生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物生成之間的3種關(guān)系.(1)相關(guān):代謝產(chǎn)物的生成伴隨著菌株生長(zhǎng),而且在菌株生長(zhǎng)開始就有代謝產(chǎn)物生成,菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后代謝產(chǎn)物的活性和生成量也達(dá)到最大,如寄生曲霉菌[16];(2)部分相關(guān):菌株生長(zhǎng)階段并無代謝產(chǎn)物生成,代謝產(chǎn)物是在菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定期產(chǎn)生的,如地衣芽孢桿菌和假單胞菌[17];(3)不相關(guān).如式(3)所示,當(dāng)m1≠0,m2=0時(shí),產(chǎn)物生成和菌株生長(zhǎng)之間相關(guān);當(dāng)m1≠0,m2≠0時(shí),產(chǎn)物生成和菌株生長(zhǎng)之間部分相關(guān);當(dāng)m1=0,m2≠0時(shí),表示產(chǎn)物生成和菌株生長(zhǎng)之間不相關(guān).

式中:P為絮凝劑產(chǎn)量,g/L;m1和m2分別是與菌株生長(zhǎng)和菌株濃度相關(guān)的參數(shù).

1.2.4 分析方法 COD濃度采用重鉻酸鉀法測(cè)定;氨氮采用鈉氏分光光度法測(cè)定;總磷采用鉬銻抗分光光度法測(cè)定;DO采用溶氧儀(HI2400)檢測(cè);pH值采用多功能pH計(jì)(DELTA320A)檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)曲線

由圖1可知,菌株接種到豬場(chǎng)廢水培養(yǎng)基中,基本不存在滯后期,這是由于試驗(yàn)中選擇的菌株菌齡和接種量較合適的原因.0～60h是菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,能充分利用豬場(chǎng)廢水中豐富的有機(jī)物和氮磷生長(zhǎng),菌體干重、細(xì)胞濃度 OD600和菌落數(shù)持續(xù)增加.12～36h,菌體干重、細(xì)胞濃度 OD600和菌落數(shù)分別由0.09g/L,0.26和1.3×107cfu迅速增加到0.76g/L,0.58和3.5×107cfu.菌株在60h進(jìn)入穩(wěn)定期,菌落數(shù)在66h達(dá)到最大(5×107cfu).78h菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期,菌體干重和細(xì)胞濃度 OD600依然有所增加,菌落數(shù)則逐漸減少.菌體干重的增加是由于其中不僅包含活菌株,還包含死亡的菌體;OD600的上升趨勢(shì)則歸因于菌死亡后引起的濁度增加;菌落數(shù)降低是由于其表述的是發(fā)酵過程中的活菌數(shù),因此,菌落數(shù)的變化能夠反應(yīng)細(xì)菌在發(fā)酵過程中的真實(shí)生長(zhǎng)趨勢(shì).

圖1 菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of the bacteria

圖2 菌株生長(zhǎng)與絮凝劑生產(chǎn)的關(guān)系Fig.2 Relations between growth and production

依據(jù)圖 1,計(jì)算菌株的繁殖代數(shù)n,生長(zhǎng)速率常數(shù)R和世代時(shí)間G得:

由圖 2可知,代謝產(chǎn)物的生成和積累基本上是伴隨著菌株的生長(zhǎng)過程,當(dāng)菌株進(jìn)入穩(wěn)定期后期時(shí),菌落數(shù)達(dá)到最大的 5×107cfu,其代謝產(chǎn)物(1.31g/L)對(duì)高嶺土懸液(4.0g/L)的絮凝率也達(dá)到了最大的 94.3%,說明代謝產(chǎn)物的生成和菌株生長(zhǎng)之間的關(guān)系屬于相關(guān)型.2.2 發(fā)酵過程參數(shù)分析

由圖 3可知,溶解氧僅在發(fā)酵初期維持較高水平,隨著絮凝菌的活躍生長(zhǎng)和代謝,發(fā)酵液中的溶解氧迅速從初始狀態(tài)(0h)的4.5mg/mL下降至0.38mg/mL (12h),并一直維持在較低水平(0.55～0.75mg/mL),這是由于大量繁殖的細(xì)菌消耗了培養(yǎng)基中絕大部分溶解氧.由此可見,在絮凝菌生長(zhǎng)過程中,培養(yǎng)初期較大的通氣量有利于絮凝劑的合成,同時(shí)可以避免菌體凝聚成顆粒,影響顆粒內(nèi)部菌體對(duì)溶解氧的吸收和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入以及代謝產(chǎn)物向細(xì)胞外的擴(kuò)散.

圖3 溶解氧、pH值隨菌株生長(zhǎng)的變化Fig.3 Changes of DO and pH value with cell growth

發(fā)酵過程中pH值先上升再下降,pH值的上升是由于絮凝菌生長(zhǎng)和代謝過程中消耗了培養(yǎng)基中的酸性多糖類物質(zhì),而代謝產(chǎn)物(蛋白質(zhì)類絮凝劑)本身不含酸性多糖類物質(zhì).隨著菌體進(jìn)入穩(wěn)定期,pH值略有下降,此時(shí)溶解氧含量極少,使得其作為最終電子受體的作用減弱,絮凝菌以有機(jī)物氧化分解的中間代謝產(chǎn)物為最終電子受體進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)生有機(jī)酸等物質(zhì),導(dǎo)致了 pH值的下降.

由圖4可知,絮凝菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),培養(yǎng)基中 COD和氨氮含量分別迅速從 1350,1283mg/L降低到 273, 241mg/L.穩(wěn)定期后期(66h),COD和總氮含量緩慢減少,并維持在低水平(220～251mg/L),這是由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,穩(wěn)定期前期和中期菌體對(duì)有機(jī)物和氮源的利用速率較快.此外,衰亡期(78～90h)氨氮的含量緩慢回升,是由于菌體細(xì)胞大量死亡及菌體自溶致使胞內(nèi)蛋白釋放到培養(yǎng)基中的緣故.

圖4 COD、氨氮隨菌株生長(zhǎng)的變化Fig.4 Changes of COD and ammonium with cell growth

圖5 總磷、pH值隨菌株生長(zhǎng)的變化Fig.5 Changes of TP and pH value with cell growth

由圖5可知,絮凝菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),總磷的含量迅速減少到 26mg/L.穩(wěn)定期后期(66h),總磷含量緩慢減少,衰亡期(78～90h)總磷含量繼續(xù)下降,說明菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期前期和中期對(duì)磷源的利用速率較快,磷不僅被菌株同化成為細(xì)胞組分,而且參與代謝過程中的磷酸化作用,用于貯存能量.此外,磷酸鹽作為緩沖劑,調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中pH的變化.圖3和圖5中pH值先上升后下降,但整體變化并不顯著,這歸因于磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用,當(dāng)培養(yǎng)基中 H+濃度增加時(shí),與弱堿性鹽(K2HPO4)結(jié)合形成弱酸性化合物,培養(yǎng)基 pH值不會(huì)過度降低;相反,pH 值也不會(huì)過度升高.總磷含量變化曲線中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中的磷源含量充足,在發(fā)酵后期仍有殘留(11mg/L).

2.3 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征

發(fā)酵過程中,初始菌體干重X0=0.02g/L,最大菌體干重Xm=1.71g/L.對(duì)式(2)進(jìn)行非線性擬合(圖 6a),得知μm=0.11.從而得到菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程:

圖6 菌株生長(zhǎng)和絮凝劑生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線Fig.6 Fitting curves of growth (a) and producing (b)kinetics model of the bacteria

對(duì)式(4)的菌株干重計(jì)算值與試驗(yàn)過程中的實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較,排除發(fā)酵起始,平均相對(duì)誤差為7.8%<10%,計(jì)算值和實(shí)測(cè)值之間的擬合度R2=0.99852,說明該方程能夠較好地?cái)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù),并準(zhǔn)確地描述菌株的生長(zhǎng)過程.

由于菌株發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的生成和菌株生長(zhǎng)之間相關(guān)(m2=0),因此,菌株產(chǎn)絮凝劑的動(dòng)力學(xué)研究主要集中在生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期.對(duì)式(3)兩邊求導(dǎo),整理后得出:

對(duì)式(5)進(jìn)行非線性擬合(圖 6b),得知m1=0.86.從而得到絮凝劑生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)方程:

對(duì)式(6)的絮凝劑產(chǎn)量計(jì)算值與試驗(yàn)過程中的實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較,在菌株生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期內(nèi),平均相對(duì)誤差為 5.9%<10%,計(jì)算值和實(shí)測(cè)值之間的擬合度R2=0.99623,說明該方程能夠較好地?cái)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù),并準(zhǔn)確地描述菌株產(chǎn)絮凝劑的動(dòng)力學(xué)過程.

3 結(jié)論

3.1 由生長(zhǎng)曲線可知,菌株在60h進(jìn)入細(xì)胞增長(zhǎng)的穩(wěn)定期,菌落數(shù)達(dá)到最大的 5×107cfu,代謝產(chǎn)物(1.31g/L)對(duì) 4.0g/L高嶺土懸液的絮凝率達(dá)到最大的94.3%.

3.2 菌株發(fā)酵過程中,COD 和氮源(氨氮)在菌株生長(zhǎng)過程中大量消耗;蛋白質(zhì)作為主要絮凝活性成分,是菌株的主要代謝產(chǎn)物,與菌體生長(zhǎng)呈相關(guān)型;磷酸鹽作為緩沖液,基本維持了菌株發(fā)酵過程中pH的恒定.

3.3 試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵過程中菌株生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物生成的動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行了擬合,經(jīng)計(jì)算,Logistic和Luedeking-Piret模型均較準(zhǔn)確的模擬了其過程.

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