陳旸升等

摘 要：結合電子克隆及RT-PCR技術獲得條斑紫菜（Porphyrayezoensis）過氧化物酶基因。該基因cDNA序列長847 bp，包含編碼245個氨基酸的開放閱讀框。生物信息學分析結果顯示，該基因編碼蛋白無信號肽序列，與高等植物擬南芥的細胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶蛋白序列同源性較高，在細胞質(zhì)中行使功能。此外，該基因的進化歷程基本符合植物從低等到高等的進化過程。

關鍵詞：條斑紫菜；抗壞血酸過氧化物酶；克??；生物信息學

中圖分類號：S968.43+1 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.003

植物在干旱、高鹽、低溫、高溫等逆境中產(chǎn)生過量的活性氧基團（Reactive oxygen species，ROS），細胞內(nèi)高濃度的ROS會引起細胞凋亡甚至壞死?？箟难徇^氧化酶（Ascorbate peroxidase，APX）是一類清除體內(nèi)過氧化氫的酶，對于植物和藻類不可缺少，它保護葉綠體及其他細胞器免受過氧化氫和由過氧化氫分解的羥基造成損傷。APX是植物抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的關鍵酶之一[1]。APX屬于多基因家族，由植物細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、過氧化物酶等細胞器中的多條同源基因組成[2]。大量研究表明，非生物脅迫條件下，植物以APX基因迅速表達、體內(nèi)抗壞血酸含量變化來響應脅迫信號[3-6]。同時，大量APX基因過表達和抑制表達的轉基因植物均不同程度地提高了對氧化脅迫環(huán)境的抵抗能力[7-9]。

條斑紫菜（Porphyrayezoensis）屬于紅毛藻綱，由于它可以小規(guī)模培養(yǎng)，生長周期短（實驗室條件2～3月），基因組比較小（260 Mbp），適合作為研究海藻生理學和分子生物學的模式生物而得到廣泛關注。目前，已經(jīng)可以得到條斑紫菜配子體和孢子體的大量EST序列。條斑紫菜生長在潮間帶，長期暴露于空氣，處于高鹽等惡劣環(huán)境中，這也使它成為研究藻類響應非生物脅迫的優(yōu)良材料[10]。本研究克隆了條斑紫菜APX基因的cDNA序列，進行了序列測定和生物信息學分析，為該基因在藻類中的作用機理和利用該基因進行作物耐鹽轉基因改良奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜葉狀體采自大連旅順黃金山近海海域。Qiagen Rneasy Plant Mini試劑盒購自Qiagen公司，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、TAKARA LA Taq和dNTPs購自TAKARA公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，DEPC、乙醇等其他試劑均購自國內(nèi)外相關公司。

1.2 條斑紫菜葉狀體總RNA提取

取100 mg材料經(jīng)液氮研磨成粉末，用RNeasy Plant Mini試劑盒提取總RNA，按實驗指導書進行，電泳檢測RNA質(zhì)量和提取量，-20 ℃保存。

1.3 引物設計及基因克隆

在條斑紫菜EST數(shù)據(jù)庫中以ascorbate peroxidase為關鍵詞進行搜索，將得到的結果下載存盤，利用DNAman軟件進行序列拼接，重疊序列拼接后用NCBI的ORF Finder在線預測開放閱讀框，推測其編碼的氨基酸序列。針對開放閱讀框設計一對引物：上游5`-CACCGCTGCCTGATCGTGCT-3`，下游5`-CAAACAACCAAGTGGCGGCTAC-3`，預計擴增長度847 bp，包含APX基因完整ORF。

取總RNA2 μL，以Oligo（dT）為引物，用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒按說明書合成cDNA第一鏈。以合成的第一鏈為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為50 μL，其中10×LA PCR Buffer II （Mg2+ Plus）5 μL，dNTP Mixture （各2.5 mmol·L-1）8 μL，上、下游引物各1 μL，LA taq（5 U·μL-1）0.5 μL，模板2 μL，水32.5 μL。

PCR擴增程序如下：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個循環(huán)；72 ℃、10 min。反應后取5 μL產(chǎn)物電泳。將PCR產(chǎn)物送生工測序。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST軟件對測序結果進行分析，用SIGNALp4.0分析信號肽。收集NCBI數(shù)據(jù)庫中的不同物種的APX序列，使用clustalW程序進行多序列比對，保守結構域分析利用prosite（http：//prosite.expasy.org/）和NCBI中的CDD預測工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）進行預測，然后用MEGA5.1進化分析樹構建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結果與分析

2.1 條斑紫菜APX基因的克隆與序列測定

以ascorbate peroxidase為關鍵詞在條斑紫菜EST數(shù)據(jù)庫中檢索，得到AV43956、AV433118、AU189028、AU189855、AV433538等多條高度相似并彼此重疊的EST序列，拼接后得到一條1 041 bp的序列。PCR產(chǎn)物大小為847 bp（圖1、圖2），與預期大小相符，含有完整的ORF。

2.2 條斑紫菜APX基因的生物信息學分析

條斑紫菜APX基因編碼蛋白的保守結構域預測（圖3）。此蛋白具有高度保守的底物結合區(qū)域，屬于植物過氧化物酶超家族的一員。

擬南芥中的8種APX蛋白分布于不同的細胞器內(nèi)，成員之間同源性較低。選取這8種APX蛋白的氨基酸序列與條斑紫菜APX蛋白的氨基酸序列進行比對。結果表明，條斑紫菜APX蛋白與擬南芥細胞質(zhì)基質(zhì)中的APX蛋白（AtAPx01，AtAPx02）同源性最高，為51%～54%。該基因與其他幾條APX蛋白的氨基酸序列同源性較低，為12%～48%。信號肽分析結果顯示，此序列不含信號肽，所以這條APX基因可能為細胞質(zhì)基質(zhì)APX。

將條斑紫菜APX編碼蛋白與擬南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麥（HvAPX）、小立碗蘚（PpAPX）、兩種溫泉紅藻（CcAPX，GaAPX）、萊茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白進行同源分析，然后用MEGA軟件鄰接法（NJ法）構建系統(tǒng)進化樹（圖4）。從結果可以看出，雙子葉植物聚為一類，單子葉植物水稻、玉米、大麥，聚為一類。苔蘚植物小立碗蘚處在藻類與高等植物之間的過渡位置。條斑紫菜與兩種溫泉紅藻親緣關系較近。綠藻處于進化樹的底部。其中紅藻和綠藻中的單細胞藻類分別處于各自分枝的底部。聚類結果與來源物種的系統(tǒng)發(fā)育模式一致。節(jié)點自展值較高，可以認為得到的進化樹結果可信。由此可見，抗壞血酸過氧化物酶基因的進化歷程基本符合植物從低等到高等的進化過程。

3 結 論

運用電子克隆及RT-PCR技術得到條斑紫菜葉狀體抗壞血酸過氧化物酶基因的cDNA序列。該基因編碼蛋白無信號肽，其蛋白結構域與高等植物相似，與其他藻類抗壞血酸過氧化物酶蛋白親緣關系接近，于細胞質(zhì)中行使功能。由于藻類中的相關報道較少，本研究為藻類中抗壞血酸相關生理生化過程的研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.

將條斑紫菜APX編碼蛋白與擬南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麥（HvAPX）、小立碗蘚（PpAPX）、兩種溫泉紅藻（CcAPX，GaAPX）、萊茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白進行同源分析，然后用MEGA軟件鄰接法（NJ法）構建系統(tǒng)進化樹（圖4）。從結果可以看出，雙子葉植物聚為一類，單子葉植物水稻、玉米、大麥，聚為一類。苔蘚植物小立碗蘚處在藻類與高等植物之間的過渡位置。條斑紫菜與兩種溫泉紅藻親緣關系較近。綠藻處于進化樹的底部。其中紅藻和綠藻中的單細胞藻類分別處于各自分枝的底部。聚類結果與來源物種的系統(tǒng)發(fā)育模式一致。節(jié)點自展值較高，可以認為得到的進化樹結果可信。由此可見，抗壞血酸過氧化物酶基因的進化歷程基本符合植物從低等到高等的進化過程。

3 結 論

運用電子克隆及RT-PCR技術得到條斑紫菜葉狀體抗壞血酸過氧化物酶基因的cDNA序列。該基因編碼蛋白無信號肽，其蛋白結構域與高等植物相似，與其他藻類抗壞血酸過氧化物酶蛋白親緣關系接近，于細胞質(zhì)中行使功能。由于藻類中的相關報道較少，本研究為藻類中抗壞血酸相關生理生化過程的研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.

將條斑紫菜APX編碼蛋白與擬南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麥（HvAPX）、小立碗蘚（PpAPX）、兩種溫泉紅藻（CcAPX，GaAPX）、萊茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白進行同源分析，然后用MEGA軟件鄰接法（NJ法）構建系統(tǒng)進化樹（圖4）。從結果可以看出，雙子葉植物聚為一類，單子葉植物水稻、玉米、大麥，聚為一類。苔蘚植物小立碗蘚處在藻類與高等植物之間的過渡位置。條斑紫菜與兩種溫泉紅藻親緣關系較近。綠藻處于進化樹的底部。其中紅藻和綠藻中的單細胞藻類分別處于各自分枝的底部。聚類結果與來源物種的系統(tǒng)發(fā)育模式一致。節(jié)點自展值較高，可以認為得到的進化樹結果可信。由此可見，抗壞血酸過氧化物酶基因的進化歷程基本符合植物從低等到高等的進化過程。

3 結 論

運用電子克隆及RT-PCR技術得到條斑紫菜葉狀體抗壞血酸過氧化物酶基因的cDNA序列。該基因編碼蛋白無信號肽，其蛋白結構域與高等植物相似，與其他藻類抗壞血酸過氧化物酶蛋白親緣關系接近，于細胞質(zhì)中行使功能。由于藻類中的相關報道較少，本研究為藻類中抗壞血酸相關生理生化過程的研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.