胡 軍，張 野，陸 姚，蔣玲玲，何淑芳

（安徽醫(yī)科大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥 230601；2.第三附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥 230061）

心肌缺血／再灌注損傷是臨床心臟病學(xué)的重要難題，缺血的心肌在循環(huán)開放后發(fā)生比閉塞時(shí)更為嚴(yán)重的急性損傷；而鞘內(nèi)嗎啡處理可以對大鼠在體心肌缺血／再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用［1-2］，因此鞘內(nèi)嗎啡處理可作為心肌保護(hù)的一種策略，具有實(shí)踐性意義。但鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理是如何介導(dǎo)心肌保護(hù)作用的機(jī)制尚未明確。有報(bào)道［3］證實(shí)中樞腦室內(nèi)給予嗎啡的抗缺血／再灌注損傷的心肌保護(hù)作用可能與其鎮(zhèn)痛作用和介導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）的釋放有關(guān)。同時(shí)一氧化氮（nitric oxide，NO）作為中樞內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞內(nèi)參與疼痛、炎癥等多種傷害性刺激信號的調(diào)制［4］。心肌缺血／再灌注作為傷害性刺激，可引起中樞內(nèi)傷害性感覺神經(jīng)元興奮并介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［5］，實(shí)驗(yàn)證明嗎啡等阿片受體激動劑在中樞可通過NO／cGMP信號通路發(fā)揮抗傷害性刺激作用［6］。因而本研究的目的在于探討NO／cGMP信號通路及其下游的蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）是否參與鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理抗心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 鹽酸嗎啡注射液1 ml：10 mg（東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號：121206-2）。Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride（非選擇性的NO合成酶阻斷劑，L-NAME）、1H-［1，2，4］Oxadiazolo［4，3-a］quinoxalin-1-one（鳥苷酸環(huán)化酶阻斷劑，ODQ）、KT5823（PKG阻斷劑）、以上3種阻斷劑均購自Sigma公司。氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma公司，濃度為 100 mmol·L-1，磷酸鹽緩沖液pH 7.4溶解）。

1.2 動物模型

1.2.1 鞘內(nèi)置管動物模型的建立［1］本研究所用動物及實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。健康成年♂SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量（300±50）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK（皖）2011-002。3% 戊巴比妥鈉60 mg·kg-1，ip。參照文獻(xiàn)［1］方法，沿脊柱在頸背部切開皮膚2 cm左右，游離肌肉組織，使寰枕膜顯露，用12G注射器針頭將寰枕膜輕刺小孔，見腦脊液從小孔流出，將PE-10導(dǎo)管從刺孔向尾端緩慢置入蛛網(wǎng)膜下腔4 cm，縫合傷口，固定導(dǎo)管。術(shù)后肌注青霉素10萬單位，單獨(dú)飼養(yǎng)3 d，常規(guī)飲食。有感覺或運(yùn)動障礙的大鼠棄用。

1.2.2 心臟缺血／再灌注損傷模型的建立［1］鞘內(nèi)置管成功的大鼠，30%戊巴比妥鈉60 mg·kg-1，ip。麻醉后行氣管切開、插管后接動物呼吸機(jī)（ALCV9型，上海奧爾科特生物科技有限公司）以室內(nèi)空氣通氣，潮氣量20～30 ml·kg-1，頻率70～80次／分。右側(cè)股動脈切開置管，接壓力傳感器和生物機(jī)能系統(tǒng)（BL-420S型，成都泰盟生物科技有限公司），記錄心電圖（electrocardiogram，ECG）、平均動脈壓（mean arterial blood pressure，MAP）、心率（heart rate，HR）；右側(cè)股靜脈切開置管補(bǔ)液。在左側(cè)胸廓4-5肋間沿鎖骨中線切開皮膚約2 cm，并置開胸器打開胸腔，游離心包腔，輕壓胸廓右側(cè)，輕推出心臟；用6-0 Prolene線（強(qiáng)生公司，美國）在肺動脈圓錐與左心耳之間結(jié)扎左冠狀動脈后把心臟放回胸腔；再用Prolene線作一線結(jié)，收緊線結(jié)即可造成左冠狀動脈阻塞。心臟原位經(jīng)15 min穩(wěn)定，收緊線結(jié)以扎閉左冠狀動脈可使心肌缺血，缺血心肌表現(xiàn)為：冠狀動脈支配的區(qū)域發(fā)紺，血壓下降，ECG呈心肌缺血改變并可出現(xiàn)心律失常；松開線結(jié)后心肌實(shí)現(xiàn)再灌注，ECG在再灌注即刻可出現(xiàn)心律失常。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 成功建立鞘內(nèi)置管模型的54只大鼠，隨機(jī)分為9組，每組6只：假手術(shù)組（SHAM組），大鼠在開胸后行冠狀動脈左前降支下穿線，但不結(jié)扎，也不給予其他處理；對照組（CON組），在缺血／再灌注前30 min內(nèi)，經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管微量泵恒速泵入生理鹽水10μl 5 min，間斷5 min，重復(fù)3次；鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理（ITMP組），在缺血／再灌注前30 min內(nèi)，經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管微量泵恒速泵入嗎啡（3μg·kg-1）［1］10μl 5 min，間斷5 min，重復(fù)3次；L-NAME+ITMP組、ODQ+ITMP組、KT5823+ITMP組分別在鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理前10 min鞘內(nèi)注射3種信號蛋白阻斷劑L-NAME（30 nmol）［7］、ODQ（11 nmol）、KT5823（20 pmol）［8］10μl；L-NAME組、ODQ組、KT5823組分別在缺血／再灌注前40 min鞘內(nèi)注射3種信號蛋白阻斷劑作為阻斷劑自身對照組。隨后除SHAM組，其余各組所有大鼠均經(jīng)歷30 min缺血，120 min再灌注（Fig 1）。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血流動力學(xué)指標(biāo)測定 觀察各組手術(shù)完成心臟穩(wěn)定15 min后（基礎(chǔ)值）、預(yù)處理完成后即刻、缺血末和再灌注末平均動脈壓（MAP）和心率（HR），計(jì)算平均動脈壓和心率乘積（rate pressure product，RPP）。

Fig 1 Experiment protocol

1.4.2 心肌梗死面積測定 再灌注120 min后，取出心臟，剔除非心臟組織，置Langendorff K-H液灌注5 min（37℃），沖洗出心肌內(nèi)殘留血液，重新結(jié)扎左冠狀動脈，并從主動脈注入0.25%Evan藍(lán)溶液，后置-80℃冰箱速凍。將冰凍的心臟放入心肌切槽，由心尖到結(jié)扎冠脈的線結(jié)處平切2 mm厚的心肌5～6片。置1%TTC溶液中，37℃（pH 7.4）溫孵15 min，取出置10%福爾馬林室溫固定12 h。染色后缺血危險(xiǎn)區(qū)呈紅色，梗死區(qū)為白色，用圖像分析軟件（Sigma Scan program 4）計(jì)算左心室體積（left ventricle，LV）、右心室體積（right ventricle，RV）、缺血危險(xiǎn)區(qū)體積（area at risk，AAR）和梗死區(qū)體積（infarct size，IS），再算出 LV+RV，用 IS／AAR表示心肌梗死面積（Fig 2）。

Fig 2 Myocardial morphometric mapmorphometric map by TTC stainning.AAR：area of risk，IS：Infarct size

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以ˉx±s表示，對于血流動力學(xué)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量資料的方差分析；其他計(jì)量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK分析。

2 結(jié)果

Tab 1 Hemodynamic parameters（±s，n＝6）

Tab 1 Hemodynamic parameters（±s，n＝6）

HR：heart rate（bpm）；MAP：mean arterial blood pressure（mmHg）；RPP：rate pressure product（mmHg／min／1000）.*P＜0.05 vs SHAM group；#P＜0.05 vs Baseline；1 mmHg＝0.133 kPa

Group Baseline Treatment Ischemia Reperfusion HR MAP RPP SHAM 367±26 84±14 31±6 365±37 85±10 31±5 367±3 HR MAP RPP HR MAP RPP HR MAP RPP 336±71 60±23 20±9 5 91±13 33±6 381±33 88±21 34±9 CON 387±50 82±13 32±9 393±21 87±20 34±9 357±38 57±11*#20±4*#349±51 66±13 23±6 ITMP 384±52 85±19 33±11 421±30 69±9 29±5 337±23 59±14*#20±5*#341±43 82±16 28±6 ITMP+L-NAME 384±44 85±16 33±10 398±37 80±7 32±2 375±31 64±14*#24±4*#377±41 65±15 25±8 ITMP+ODQ 394±24 82±14 32±7 384±26 87±9 33±3 389±34 55±13*#22±7*#382±49 65±16 25±7 ITMP+KT5823 387±33 86±18 34±9 351±45 76±10 26±4 384±60 56±15*#22±7*#355±43 61±13 22±4 NOS 376±35 88±24 34±13 383±41 93±14 36±8 383±21 72±10*#28±4*#315±98 70±23 23±12 ODQ 372±16 85±9 32±5 386±33 90±13 35±6 399±38 59±8*#23±4*#333±49 66±13 22±6 KT5823 374±30 85±15 32±8 383±40 87±8 33±3 368±26 68±13*#25±5*#

2.1 血流動力學(xué)指標(biāo) 與SHAM組比較各組MAP和RPP在缺血末有降低 （P＜0.05），與基礎(chǔ)值比較，除SHAM組外，其余各組MAP和RPP在缺血末有降低（P＜0.05）（Tab 1）。

2.2 心臟病理指標(biāo)改變 各組左心室體積（LV）與右心室體積（RV）之和、AAR體積差異無顯著性（P＞0.05）。與CON組相比，ITMP組的IS體積和IS／AAR均明顯降低 （P＜0.01）；與 ITMP組比較，LNAME+ITMP組、ODQ+ITMP組、KT5823+ITMP組的IS體積和IS／AAR均明顯升高（P＜0.01），表明NO／cGMP信號通路以及PKG的阻斷劑可消除鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理對心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用（Tab 2）。

Tab 2 Myocardial morphometric analysis±s，n＝6）

Tab 2 Myocardial morphometric analysis±s，n＝6）

LV：left ventricle；RV：right ventricle；AAR：area at risk；IS：infarct size.**P＜0.01 vs CONgroup；##P＜0.01 vs ITMPgroup

Group LV+RVvolume／cm3 AARvolume／cm3 ISvolume／cm3IS／AAR／%.9 SHAM 0.87±0.06 0.46±0.06 0 0 CON 0.84±0.06 0.42±0.03 0.22±0.03 51.3±5.7 ITMP 0.74±0.07 0.41±0.03 0.12±0.03**29.7±5.0**L-NAME+ITMP 0.86±0.05 0.42±0.04 0.22±0.01## 53.4±6.1##ODQ+ITMP 0.79±0.09 0.44±0.03 0.22±0.02## 48.9±5.2##KT5823+ITMP 0.81±0.04 0.45±0.05 0.23±0.04## 49.8±7.2##L-NAME 0.85±0.09 0.44±0.02 0.24±0.05 50.9±5.9 ODQ 0.85±0.10 0.43±0.06 0.21±0.02 50.0±2.6 KT5823 0.83±0.04 0.42±0.04 0.22±0.03 52.7±7

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理可以減輕心肌缺血／再灌注損傷，并且脊髓內(nèi)神經(jīng)元的NO／cGMP信號通路，及其下游的PKG可能參與介導(dǎo)這種心肌保護(hù)作用。

脊髓內(nèi)傷害性感覺神經(jīng)元作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，不但接受外周傷害性刺激的傳入，還可以通過其末梢釋放神經(jīng)肽調(diào)節(jié)外周血管舒張［9］。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)中樞腦室內(nèi)嗎啡預(yù)處理，就可以介導(dǎo)具有強(qiáng)烈血管舒張作用的神經(jīng)肽-降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）在外周釋放［10］。缺血、疼痛以及炎癥等作為傷害性刺激可以通過心臟感覺神經(jīng)（Aδ和C纖維）引起脊髓內(nèi)傷害性感覺元的興奮，并導(dǎo)致脊髓內(nèi)的P物質(zhì)表達(dá)增加［5］。而NO作為中樞內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對傷害性信號的感知有雙重調(diào)節(jié)作用［4］。很多研究都證實(shí)NO作為阿片受體激動劑的重要中間介質(zhì)在中樞和外周調(diào)節(jié)其抗傷害作用［7，11-12］。嗎啡可以刺激3種類型的NO合酶在體內(nèi)的合成，升高NO合酶mRNA和神經(jīng)性NO合成酶 （neuronal nitric oxide synthase，nNOS）的表達(dá)［6］。NO通過作用于鳥苷酸環(huán)化酶（GC）誘導(dǎo)GTP的環(huán)化生成cGMP［4］。同時(shí)NO／cGMP也介導(dǎo)其他阿片受體激動劑的抗傷害鎮(zhèn)痛作用［13］；綜合起來看，NO／cGMP可能是阿片藥物發(fā)揮抗傷害鎮(zhèn)痛作用的基礎(chǔ)信號傳導(dǎo)通路。在我們的研究里通過鞘內(nèi)注射NO合成酶阻斷劑L-NAME或者鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ都可以阻斷嗎啡的心肌保護(hù)效應(yīng)。

NO／cGMP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能與激活蛋白激酶G（PKG）開放細(xì)胞膜ATP敏感性K+通道有關(guān)，PKG作為cGMP下游信號蛋白可以活化ATP敏感性K+通道［14］。此外也有研究顯示出ATP敏感性K+通道的激活劑可以增強(qiáng)阿片藥物的抗傷害鎮(zhèn)痛作用［15］。據(jù)此我們推斷嗎啡可能是通過NO／cGMP信號通路，激活其下游PKG調(diào)節(jié)脊髓傷害性刺激感受神經(jīng)元的ATP敏感性K+通道，形成K+外流，使細(xì)胞膜超極化，提高神經(jīng)元興奮閾值，增強(qiáng)其對缺血等傷害性刺激的耐受而減輕心肌缺血／再灌注損傷，誘導(dǎo)心肌保護(hù)效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中通過鞘內(nèi)注射PKG的阻斷劑KT5823，阻斷鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。同時(shí)也有研究證明NO可以通過胸段脊髓交感節(jié)前神經(jīng)元對調(diào)節(jié)心血管活動［16］，但是在我們的研究中，在各實(shí)驗(yàn)組中未能發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)給予嗎啡或NO／cGMP信號通路相關(guān)阻斷劑對血流動力學(xué)參數(shù)有影響，這可能是其藥物處理的方式與我們的研究不同而致。

我們的研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理對在體大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用可能與NO／cGMP信號通路以及其下游的PKG有關(guān)。

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