李建立，高冬艷，杜彥茹，侯艷寧

（1.河北省人民醫(yī)院麻醉科，河北石家莊 050051；2.白求恩國(guó)際和平醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050082）

Ikononmidou等［1］發(fā)現(xiàn)，出生 14 d內(nèi)的新生大鼠使用NMDAR拮抗劑（MK-801）后能引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡樣損傷，成年大鼠卻沒(méi)有出現(xiàn)此現(xiàn)象，說(shuō)明在大鼠腦發(fā)育高峰期（出生前1 d至出生后14 d）使用NMDAR拮抗劑會(huì)干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。氯胺酮作為一種NMDAR拮抗劑，最近大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的快速發(fā)育期反復(fù)應(yīng)用氯胺酮可以影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加，甚至影響成年后的學(xué)習(xí)記憶功能［2-3］。另外多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明氯胺酮可導(dǎo)致原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元凋亡［4-5］。氯胺酮廣泛應(yīng)用于小兒麻醉，其神經(jīng)毒性令人擔(dān)憂，因此尋找有效的措施防范氯胺酮的發(fā)育期神經(jīng)毒性變得尤為迫切。內(nèi)源性神經(jīng)甾體是一類由腦組織經(jīng)膽固醇在各種酶的作用下合成的甾類化合物，被稱為第四類神經(jīng)遞質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，不僅參與生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟及衰老過(guò)程，也參與對(duì)焦慮、抑郁、睡眠、情緒反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)［6］。雌二醇作為一種內(nèi)源性神經(jīng)活性甾體，近年來(lái)大量研究表明對(duì)多種神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，日益受到重視［7］。然而17β雌二醇是否保護(hù)皮層神經(jīng)元免受氯胺酮導(dǎo)致的凋亡尚不清楚，因此本文就此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 氯胺酮（福建古田藥業(yè)有限公司，批號(hào) H35020148）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)液、B27促生長(zhǎng)劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LY294002、17β雌二醇、DMSO、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)Mannheim公司；胰蛋白酶購(gòu)自北京索來(lái)寶公司；Akt和pAkt抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司。

1.2 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)方法［8］，略加改進(jìn)。取新生24 h內(nèi)的SD幼鼠，無(wú)菌操作下迅速取出大腦，用D-Hanks液清洗后取出大腦皮質(zhì)，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，經(jīng)0.125%胰蛋白酶37℃消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，然后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液。然后經(jīng)100目鋼絲篩過(guò)濾，計(jì)數(shù)后按1×109·L-1的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，全量換neurobasal+B27培養(yǎng)基，以后每隔2天半量換液1次。體外培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 觀察氯胺酮對(duì)神經(jīng)元存活率影響時(shí)，氯胺酮終濃度分別為0、1、10、100、1 000μmol·L-1。觀察17β雌二醇對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用時(shí)，分為對(duì)照組、氯胺酮組（氯胺酮終濃度為100μmol·L-1）、氯胺酮+17β雌二醇組（氯胺酮終濃度為100 μmol·L-1，17β雌二醇終濃度分別為 0.001、0.01、0.1、1μmol·L-1）。檢測(cè)各種處理對(duì)神經(jīng)元形態(tài)、神經(jīng)元凋亡和pAkt蛋白表達(dá)的影響時(shí)，分為對(duì)照組、氯胺酮組（終濃度為100μmol·L-1）、氯胺酮+17β雌二醇組（氯胺酮100μmol·L-1，17β雌二醇0.1μmol·L-1），氯胺酮 +17β雌二醇 +LY294002組（氯胺酮100μmol·L-1，17β雌二醇 0.1μmol·L-1，LY294002 10μmol·L-1）。

1.4 MTT法檢測(cè)神經(jīng)元存活率 將細(xì)胞接種于96孔板，體外培養(yǎng)至d 7分別加入不同的藥物處理24 h，翻板法棄去培養(yǎng)液，每孔加入10μl MTT液，37℃孵育4 h，棄上清，加入200μl DMSO，輕輕振蕩溶解甲臜結(jié)晶，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm的吸光度值。以對(duì)照組平均吸收值為100%，以各處理組吸收值與對(duì)照組的比值計(jì)算存活率。

1.5 神經(jīng)元凋亡的檢測(cè) 應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)凋亡神經(jīng)元。將細(xì)胞涂片用4%多聚甲醛室溫下固定30 min，然后PBS洗3次，0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶30 min，然后在0.1%Triton X-100的0.1%檸檬酸鈉溶液中4℃孵育5 min，將50μl TUNEL反應(yīng)液在37℃濕盒中反應(yīng)60 min，PBS沖洗3次，然后再加入50μl可轉(zhuǎn)變還氧化酶反應(yīng)液，37℃濕盒中孵育30 min，最后加入50μl底物反應(yīng)液室溫反應(yīng)10 min。光鏡下觀察神經(jīng)元，細(xì)胞核有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性神經(jīng)元，采取5個(gè)不同的視野，計(jì)算陽(yáng)性和陰性細(xì)胞數(shù)量。

1.6 Western blot法測(cè)定p Akt蛋白表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)各種處理后，收集細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)樣品蛋白含量。取待測(cè)蛋白質(zhì)50μg加上樣緩沖液煮沸變性，于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中100V電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜2 h，加入 Akt、pAkt抗體（1∶2 000），4℃過(guò)夜，常規(guī)洗滌，加羊抗鼠二抗（1∶5 000），37℃孵育60 min，洗滌，電化學(xué)法發(fā)光，顯影，掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶吸光度的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)Akt蛋白為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析（ANOVA）和SNK檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 各種處理神經(jīng)元存活率變化 神經(jīng)元經(jīng)過(guò)1、10、100、1 000μmol·L-1的氯胺酮處理 24 h后，存活率分別為（98.03±5.55）%、（79.34±5.01）%、（58.17±2.84）%、（31.41±1.84）%，其中10、100、1 000μmol·L-1氯胺酮處理后神經(jīng)元存活率明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn) Fig 1。100μmol·L-1氯胺酮處理神經(jīng)元的同時(shí)分別加入0.001、0.01、0.1、1μmol·L-1的17β雌二醇共同處理24 h后，其存活率分別為（54.78±5.05）%、（75.1±9.25）%、（88.33±8.54）%、（79.54±10.25）%，其中0.1μmol·L-117β雌二醇保護(hù)效果最好，見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Effect of 17β-estradiol treatment on neuron viability±s，n＝6）**P＜0.01 vs control；##P＜0.01 vs ketamine

2.2 各種處理對(duì)神經(jīng)元形態(tài)的影響 對(duì)照組神經(jīng)元胞體豐滿，突起較長(zhǎng)，相互之間神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接緊密。100μmol·L-1氯胺酮處理24 h后，神經(jīng)元胞體立體感消失，顏色變暗，細(xì)胞輪廓不清，神經(jīng)元軸突斷裂，部分死亡。0.1μmol·L-117β雌二醇與100μmol·L-1氯胺酮共處理部分逆轉(zhuǎn)了氯胺酮引起的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化。而 10μmol·L-1LY294002拮抗了17β雌二醇對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，見(jiàn)Fig 3。

2.3 各種處理對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響 100μmol·

L-1氯胺酮處理神經(jīng)元24 h后，TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元較對(duì)照組明顯增加，而加入0.1μmol·L-117β雌二醇共同處理24 h，TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元較氯胺酮組明顯減少，而 10μmol·L-1LY294002預(yù)處理組TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元較17β雌二醇+氯胺酮組明顯增加，見(jiàn)Fig 4。

Fig 3 Effect of different treatments on structure of neuronsa：Control；b：Ketamine；c：17β-estradiol+ketamine；d：17β-estradiol+ketamine+LY294002

Fig 4 Effect of 17β-estradiol treatment on neuronal apoptosis induced by ketamine exposure（±s，n＝6）**P＜0.01 vs control；##P＜0.01 vs ketamine；ΔΔP＜0.01 vs ketamine+17β-estradiol.a：Control；b：Ketamine；c：17β-estradiol+ketamine；d：17β-estradiol+ketamine+LY294002

2.4 各種處理對(duì)pAkt蛋白表達(dá)的影響 100μmol·L-1氯胺酮處理神經(jīng)元2 h后，pAkt蛋白表達(dá)降低，明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。氯胺酮與17β雌二醇共處理2 h后，pAkt蛋白表達(dá)較氯胺酮單純處理組明顯增加（P＜0.01）。加入LY294002后pAkt蛋白表達(dá)降低，明顯低于氯胺酮+17β雌二醇組（P＜0.01），見(jiàn) Fig 5。

Fig 5 Effect of different treatments on p Akt level（±s，n＝6）**P＜0.01 vs control；##P＜0.01 vs ketamine；ΔΔP＜0.01 vs ketamine+17β-estradiol.

3 討論

人類大腦的快速發(fā)育期為懷孕后3個(gè)月到出生后3年，全世界每年都有數(shù)百萬(wàn)嬰幼兒在此時(shí)間內(nèi)由于各類外科手術(shù)或診斷需要等原因接受全身麻醉。氯胺酮是嬰幼兒麻醉最為常用的麻醉劑，最近研究表明，發(fā)育期大腦應(yīng)用氯胺酮可引起神經(jīng)元的大量凋亡［2-5］。因此氯胺酮的臨床應(yīng)用，尤其是在嬰幼兒中的應(yīng)用，引起了廣泛的關(guān)注。針對(duì)麻醉藥引起的發(fā)育期大腦損傷，NIH、FDA以及IARS要求研究者不僅要研究其發(fā)生機(jī)制，而且要尋找有效的措施來(lái)防治麻醉藥所引起發(fā)育期神經(jīng)損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮對(duì)原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元產(chǎn)生劑量依賴性損傷，氯胺酮引起的神經(jīng)元損傷機(jī)制目前仍不清楚。據(jù)推測(cè)，持續(xù)暴露于氯胺酮可以引起神經(jīng)元NMDA受體亞單位，尤其是NR1亞單位的上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的調(diào)亡，而給予NR1反義寡核苷酸可以抑制NR1蛋白的合成，進(jìn)而減輕氯胺酮引起的神經(jīng)元調(diào)亡［9］。

近年來(lái)，對(duì)如何防治氯胺酮引起的發(fā)育期大腦損傷進(jìn)行了一系列研究，研究表明維生素D、鋰、促紅細(xì)胞生成素、肉毒堿、煙酰胺、可樂(lè)定等對(duì)氯胺酮引起的發(fā)育期神經(jīng)損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［4，10-14］。雌二醇作為一種內(nèi)源性神經(jīng)活性甾體，有研究表明，17β雌二醇可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活以及功能維護(hù)［15-16］。另有研究表明 17β雌二醇可以對(duì)NMDAR拮抗劑MK801所引起的發(fā)育期大腦調(diào)亡樣損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［17］。另外 Lu等［18］研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇可對(duì)咪達(dá)唑侖、笑氣、異氟醚聯(lián)合應(yīng)用所引起的發(fā)育期大鼠大腦廣泛凋亡樣損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。然而17β雌二醇是否對(duì)氯胺酮所導(dǎo)致皮層神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生保護(hù)作用以及機(jī)制目前還不清楚，本文對(duì)此進(jìn)行了研究。本研究發(fā)現(xiàn)17β雌二醇可對(duì)氯胺酮導(dǎo)致的皮層神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，激活PI3KAkt信號(hào)通路可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一。

PI3K-Akt信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條參與細(xì)胞增殖調(diào)控的重要信號(hào)通路。PI3K通過(guò)催化底物Akt磷酸化而將活化信號(hào)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部。Akt是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，被激活的Akt在Ser-473和Thr-308位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活等。同時(shí)NMDA受體在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸形成等方面具有重要的作用，還具有促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用，這一作用是通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，作為NMDAR拮抗劑氯胺酮通過(guò)降低神經(jīng)元pAkt蛋白的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，這與以往的研究結(jié)果一致［5，12］。另外研究表明PI3K-Akt信號(hào)通路是雌二醇發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要通路［17-18］。因此我們假設(shè)17β雌二醇保護(hù)皮層神經(jīng)元免受氯胺酮導(dǎo)致的凋亡是通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)各種處理對(duì)皮層神經(jīng)元pAkt蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)氯胺酮與17β雌二醇共同作用使神經(jīng)元pAkt蛋白表達(dá)增加。為了進(jìn)一步證實(shí)PI3K-Akt信號(hào)通路在17β雌二醇對(duì)抗氯胺酮神經(jīng)毒性中的作用，我們應(yīng)用了PI3K抑制劑LY294002，觀察其對(duì)神經(jīng)元pAkt蛋白表達(dá)以及神經(jīng)元凋亡的影響，結(jié)果表明LY294002抑制了17β雌二醇誘導(dǎo)pAkt表達(dá)的上調(diào)作用，同時(shí)抑制了17β雌二醇的神經(jīng)保護(hù)作用，使神經(jīng)元凋亡增加。

總之，氯胺酮導(dǎo)致了原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡，這一作用是通過(guò)阻斷NMDA受體，下調(diào)pAkt蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。17β雌二醇具有保護(hù)神經(jīng)元免受氯胺酮損傷的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究為圍手術(shù)期應(yīng)用17β雌二醇預(yù)防氯胺酮對(duì)嬰幼兒大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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