袁辰剛，楊海榮，楊捷琳，*，吳 楊，陳 穎，潘良文，何宇平

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海200135；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100123；3.上海友科生物科技有限公司，上海201203）

克諾羅桿菌，原名阪崎腸桿菌。2008年，Iversen建議將阪崎腸桿菌重新分類，成為腸桿菌科1個新屬，即克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.）。包括5個新種（其中Cronobacter sakazakii稱為新組合）、1個克羅諾桿菌基因種（genomospecies）和三個新亞種[1-3]，2011年增加了一個新種C.condimenti[4]。Mullane等[5]對克諾羅桿菌O抗原的研究結果也支持這一新分類方法。

克諾羅桿菌作為近年來日漸受到關注的食源性致病菌，感染多見于新生兒和出生3d到4歲左右的嬰幼兒，其中尤以免疫力低下兒童為主。目前為止有9例成人感染克諾羅桿菌病例的報道[6]。該菌能夠引起嬰兒腦膜炎、膿血癥和小腸結腸炎[7]，在牛奶中易于形成生物膜，也使這一致病菌的防控更加困難[8]。1961年到2003年報道的76個病例中19例死亡，綜合統(tǒng)計死亡率高達50%以上[9-10]，也使得各方面對這一污染來源、生態(tài)學及毒力因子尚不清楚的微生物更加關注。WHO/FAO會議將克諾羅桿菌列為“A”類細菌，即已經確證能夠引起人類疾病的高風險性食源性病原菌[11]。Muytjens等發(fā)現，來自35個國家的141種嬰兒配方奶粉約14%含有克諾羅桿菌，含量從0.36 ～66.0CFU/100g不等[12]。Nazarowec-White和Farber測試了加拿大5家不同公司的120罐嬰兒配方奶粉，發(fā)現其中6.7%含有克諾羅桿菌，陽性樣品中克諾羅桿菌的量通常是0.36CFU/100g[13]。2004年，我國阜陽劣質奶粉樣品中阪崎腸桿菌（克諾羅桿菌）污染率為12.6%[14]。

現行的《GB 4789.40-2010食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗》中，利用克諾羅桿菌特有的α-葡萄糖苷酶活性，采用DFI選擇性平板培養(yǎng)進行分離檢驗。整個檢測過程需要4 ～5d才能完成，周期較長。目前建立的克諾羅桿菌快速檢測方法以分子生物學檢測方法為主，存在專業(yè)技能要求高，設備昂貴，難以區(qū)分死活細菌的弊端，而免疫學檢測方法的建立以獲得特異性、靈敏度較好的抗體為基礎，一旦建立，具有應用簡便，成本低廉，快速，高通量等多重優(yōu)勢。

克諾羅桿菌屬這一新屬的建立，說明了克諾羅桿菌分類學地位上的復雜性。目前，克諾羅桿菌代表菌株種類已有9株，菌株之間DNA同源性差異較大，因此增加了抗體制備的復雜性[2-4]。本文以克諾羅桿菌多個代表菌株為抗原，進行了單抗原、多抗原單獨免疫、組合免疫的多種嘗試，篩選制備克諾羅桿菌的單克隆抗體，為建立克諾羅桿菌免疫學快速檢測方法打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克諾羅桿菌（8株標準菌株）購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Tissue Culture Collection，ATCC）及德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）菌種保藏中心；大腸桿菌（ATCC 25922）、沙門氏菌（ATCC 13076）、陰溝腸桿菌（ATCC 13047）、志賀菌（ATCC 25931）、奇異變形桿菌（ATCC 12453）、肺炎克雷伯氏菌（ATCC 27336）均為上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗技術中心保存；6 ～8周齡雌性BABL/c小鼠 體質量20g左右，購自第二醫(yī)科大學實驗動物中心；福氏佐劑、PEG 4000、HAT、Protein G Sepharose、HRP標記的羊抗鼠IgG及小鼠Ig亞類檢測試劑盒 均購自Sigma公司；Protein G Sepharose硝酸纖維膜 購自上海生工生物技術公司；RPMI1640培養(yǎng)基 Gibco公司產品；胎牛血清 Hyclone公司產品；小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0 中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心（IQCC）保存。

二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋；倒置顯微鏡 上海蔡康；超凈工作臺 上海上凈；恒溫搖床 上海天呈；超聲破碎儀 寧波新芝；酶標儀 美國Thermo。

1.2 實驗步驟

1.2.1 動物免疫 克諾羅桿菌標準菌接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃250r/min搖培養(yǎng)過夜，0.5%甲醛滅活，10000r/min離心10min棄上清液，菌體用10mL無菌PBS重懸?？乖苽洳捎脙煞N方式結合：a：超聲裂解：菌體懸液超聲裂解，超聲功率300W，超聲12s，停12s，每輪3min，2輪，裂解液離心（10000r/min，10min），棄去沉淀，上清液即為細菌裂解蛋白溶液；b：凍融裂解：4℃離心細菌培養(yǎng)物，PBS洗3次，液氮反復凍融三次，13000r/min冷凍離心后取上清液。四倍體積冷丙酮沉淀蛋白并洗滌沉淀兩次去除色素等雜質，冷凍保存?zhèn)溆?。兩種方式制備的細菌裂解物按1∶1比例混合作為抗原使用。

克諾羅桿菌的標準菌株共8株，分別為ATCC 29544、ATCC 51329、NCTC 9529、DSM 18702、DSM 18703、DSM 18705、DSM 18706、DSM 18707，按照克諾羅桿菌新屬的分類學研究，每個標準株代表一個種或亞種的克諾羅桿菌，不同的種或亞種之間基因差異較大，因此推測其免疫原性也存在差別。因此，選擇8株標準菌株中部分進行免疫，分別為DSM 18702、DSM 18705、NCTC 9529、ATCC 29544。

細菌裂解蛋白溶液用BCA法確定蛋白濃度，即為抗原蛋白，抗原用PBS稀釋至1.5mg/mL，分裝凍存于-20℃，第一次免疫取1000μL抗原與1000μL福氏完全佐劑混合，乳化，腹腔注射6只小鼠；14d后，取1000μL抗原與1000μL福氏不完全佐劑混合，乳化，腹腔注射6只小鼠免疫；第二次免疫14d后進行第三次免疫，取1000μL原與1000μL福氏不完全佐劑混合，乳化，腹腔注射6只小鼠；第36d進行第四次免疫。第四次免疫間隔3d后，小鼠眼眶靜脈采血，收集血清，Elisa檢測小鼠血清效價，血清效價大于104時，即達到進行融合的最低標準。融合前3d進行加強免疫，取50μg抗原直接腹腔注射6只小鼠；選定合格的小鼠，3d后進行細胞融合。

2018年培訓內容和形式已逐漸趨向成熟?？紤]以后將手機、電腦聯機，操作通過掃描大屏二維碼注冊使用中、外文數據庫，演示檢索過程，讓新員工有更直觀的認識和更深入地參與。

1.2.2 細胞融合 選擇處于對數生長期的SP2/0細胞，用彎頭吸管將細胞吹下，收集于50mL離心管中，離心棄上清液，用DMEM培養(yǎng)基將細胞重懸調整細胞數，置孵箱中備用。小鼠摘眼球取血收集血清作為陽性對照，取脾臟經篩網研磨后收集脾細胞進行融合，將脾細胞與SP2/0細胞混勻，1200r/min離心5min，盡量棄去上清液，將細胞彈松，吸1mL預熱的融合劑（PEG1450），在1 min內逐滴加入，再放置37℃水浴中反應1min，然后加入終止液（在5min內加入25mL DMEM培養(yǎng)基，并輕輕攪拌細胞），1200r/min離心5min。棄去上清液，加入100mL預熱的HAT培養(yǎng)基，將細胞重懸，輕輕混勻（用吸管從底部吸起細胞，在液面頂部輕輕盤旋滴入）。用排槍加入預先接種飼養(yǎng)細胞的96孔板中，每孔100μL，鋪10塊板，置孵箱中培養(yǎng)，有限稀釋后接種96孔板，每孔100μL，鋪10塊板，常規(guī)方法進行單克隆。

1.2.3 ELISA檢測抗體效價 將抗原用CBS稀釋為10μg/mL，加入酶標板中，每孔100μL，4℃過夜。將包被液棄去，每孔加入200μL封閉液（5%脫脂奶粉），37℃放置1.5h。棄去封閉液，加入樣品，每孔100μL加入酶標板，37℃放置1h。酶標羊抗鼠用封閉液稀釋至工作濃度，每孔100μL加入酶標板，37℃放置30min，用自來水沖洗10次，拍干，加入TMB顯色底物，每孔100μL加入酶標板，37℃放置15min，每孔加入2mol/L H2SO450μL終止液，酶標儀OD450nm讀數。

表1 克諾羅桿菌單克隆抗體制備中所用菌株Table 1 Strains used in Cronobacter sakazakii monoclonal antibody screen

1.2.4 抗體腹水制備 預先腹腔注射石蠟油到小鼠體內，將雜交瘤細胞用彎頭吸管吹打制成懸液，計數，用少量DMEM將細胞重懸，腹腔注射入石蠟鼠體內（每只小鼠注射2×106細胞），處死小鼠吸出腹水，并取少量Elisa檢測腹水效價，Protein G柱純化，PBS透析過夜，Elisa檢測效價。Protein G純化抗體，紫外吸收測定濃度，SDS-PAGE進行純度分析，-20℃分裝保存。

1.2.5 抗體特異性鑒定 Western blot鑒定：將克諾羅桿菌（ATCC29544）、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、陰溝腸桿菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌各取少量菌液與2×Loading Buffer等體積混合均勻后煮沸10min，每孔12μL上樣（上樣量約為20μg全菌蛋白），SDS-PAGE電泳，轉膜（300mA，1h），用5%脫脂奶粉封閉過夜，抗體稀釋至1μg/mL，室溫振蕩孵育1h，洗滌3次，用GE的ECL-PLUS試劑盒曝光，將成像后的膠片掃描保存。

ELISA鑒定：用滅活的菌體作為抗原包被96孔酶標板，采用間接ELISA法，設置空白、陽性、陰性對照，分別和20種不同菌株進行交叉反應實驗。

1.2.6 單克隆抗體亞類鑒定 按照mAb亞類檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 親和力的測定 以80、40、20、10、5、2.5ng/mL濃度的菌體抗原包被96孔板，間接ELISA法檢測相應的OD值，以1000 ～0ng/mL對倍稀釋的mAb對數值為橫坐標，以其相應的OD值為縱坐標，繪制出測定曲線，以各曲線上部趨于平坦段的OD值為100%，查出其OD值為50%時的mAb濃度，根據公式計算每株mAb的親和力常數。

1.3 膠體金檢測試紙條的制備

1.4 靈敏度及特異性測試

取阪崎腸桿菌標準菌株ATCC 29544，37℃過夜培養(yǎng)，10倍梯度稀釋，添加到購買的牛奶中使細菌終濃度達到10 ～108CFU/mL，按照GB 4789.40-2010食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗中所述方法，取檢樣加入緩沖蛋白胨水，充分混勻后（36±1）℃培養(yǎng)（18±2）h。將每個梯度的菌液取1mL進行膠體金試紙條檢測，同時以緩沖蛋白胨水作為空白對照。取克諾羅桿菌標準菌株代表株、分離菌株及其他陰性菌株包括沙門氏菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、枸櫞酸桿菌、志賀氏菌、變形桿菌等，接種于5mL肉湯37℃過夜培養(yǎng)，取1mL進行膠體金試紙條檢測，同時以緩沖蛋白胨水作為空白對照，確定克諾羅桿菌膠體金試紙條的特異性。

2 結果與討論

2.1 雜交瘤細胞株的篩選和亞克隆

抗原免疫后，雜交瘤細胞株建立過程中進行2次融合，融合率在90%以上。細胞融合10d后，雜交瘤細胞克隆生長至肉眼可見時，采用間接ELISA對其進行檢測，抗原采用超聲破碎、凍融及全抗原，檢測結果表明，超聲破碎的抗原檢測陽性率最高。篩選出效價高，特異性好或覆蓋面大的細胞孔進行三次以上的亞克隆。細胞融合時，在HAT選擇培養(yǎng)下，一些未融合或自身融合的細胞死亡，背景雜亂，經亞克隆培養(yǎng)后，可見背景相對干凈的單個克隆生長。經篩選和檢測獲得6株能穩(wěn)定分泌mAb的雜交瘤細胞株，分別命名為：5A8、2H1、1F2、4H11、2H8、5C4。

2.2 單克隆抗體特異性鑒定

選擇克諾羅桿菌陽性菌株共20株，包括8株標準菌株及12株分離株，以及克諾羅桿菌同屬的陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌以及常見的食源性致病菌等9株作為陰性對照，共29種菌進行交叉反應實驗（見表2）。從反應結果來看，克諾羅桿菌各標準菌株單獨或混合作為免疫原，獲得的抗體性質差異較大，DSM18702免疫的小鼠選取2只進行兩次融合，都沒有篩選到陽性克隆，DSM 18705免疫的小鼠進行融合，篩選到陽性克隆，最后建株的單克隆抗體細胞株均來自菌株DSM 18705免疫所獲得。在所有篩選獲得的細胞株中，5A8針對所有的測試細菌都有反應，雖然該抗體的特異性較差，但由于5A8與實驗中所有的克諾羅桿菌標準菌株和分離菌株都呈陽性反應，覆蓋面最大，可以在后續(xù)的膠體金試紙條制備及試劑盒研發(fā)等實際產品的應用開發(fā)中作為捕獲抗體，可以提高檢測的靈敏度，因此在最后的篩選過程中予以保留（見表2）。

圖1 Western Blot檢測克諾羅桿菌5C4抗體特異性Fig.1 Weatern Blot test of C.sakazakii mAb 5C4 specificity

表2 單克隆抗體特異性測試Table 2 Specificity test for established C.sakazakii Mabs

采用Western Blot鑒定抗體特異性（圖1），結果表明，獲得的5C4抗體用于克諾羅桿菌ATCC29544檢測有陽性條帶出現，但對于腸炎沙門氏菌、陰溝腸桿菌、福氏志賀氏菌、粘質沙雷氏菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌、普通變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等對照菌株沒有反應條帶出現。

2.3 細胞培養(yǎng)上清液和腹水效價測定

分別收集陽性雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水，按10倍梯度稀釋，間接ELISA方法檢測效價，以P/N值≥2.1時的最高稀釋倍數為此單抗的效價，所制備的單克隆抗體及腹水效價均能達到1×107以上。

2.4 單克隆抗體亞類鑒定及親和力的測定

采用抗體亞類試劑盒測定，6株單克隆抗體1F2、5C4、2H8、5A8、4H11、2H1的Ig亞類分別為IgG3、IgG2b、IgG3、IgG1、IgG3、IgG1（見表3）。間接ELISA法測定本研究中的6株mAb的相對親和常數均大于1.0×1010L/mol，顯示制備的單抗與克諾羅桿菌的親和力高（見表4）。

表3 單克隆抗體亞類鑒定Fig.3 Subgroup identification of MAb

表4 克諾羅桿菌抗體親和常數的測定Fig.4 Measurement of affinity constant bycompetitive

2.5 膠體金試紙條靈敏度及特異性測試

將克諾羅桿菌培養(yǎng)物梯度稀釋后，用于計數和膠體金試紙條檢測，以確定本方法的靈敏度。結果顯示，試紙條檢測靈敏度為105CFU/mL。結果顯示，試紙條僅對克諾羅桿菌菌株檢測為陽性，對其他細菌檢測結果均為陰性。

3 討論

針對食源性致病菌的檢測，免疫學方法一直是必不可少的，具有高通量、快速簡便、適合現場篩查使用等多項優(yōu)勢，ELISA、免疫磁珠、層析試紙條等技術已經成為目前的主流方向。常規(guī)的分離培養(yǎng)和生理生化檢測，周期長，工作量大，不利于疾病爆發(fā)時準確、快速地溯源檢測，但免疫學方法建立的基礎是獲得穩(wěn)定、高效表達的抗體[15]。

本文采用克諾羅桿菌多株代表菌株DSM 18702、DSM 18705、NCTC 9529、ATCC 29544進行免疫，希望能獲得覆蓋面較廣、特異性較好的單克隆抗體。在整個單克隆抗體制備的過程中，進行了多次細胞融合，多次篩選，工作量極大。實驗獲得了6株克諾羅桿菌的單克隆抗體。一株與多株陰性菌存在交叉反應，但同時也能與所有的克諾羅桿菌陽性菌株反應。將該細胞株建立優(yōu)化后保藏，希望該細胞株反映的廣泛性能夠在后面的檢測中獲得運用。同時，實驗挑選了5株能夠和不同克諾羅桿菌標準株進行反應，并且具有良好特異性的單克隆抗體細胞株建株，這5株細胞株的結合能夠完全覆蓋克諾羅桿菌8株代表性標準菌株以及實驗中所用的12株分離株。在Western檢測抗體特異性的實驗中，選擇了部分克諾羅桿菌和陰性菌株的部分代表菌株，并將這些菌株放在同一張Western檢測膜上，以減少實驗條件帶來的誤差。本研究的目的是希望將制備獲得的抗體用于最終的實際檢測中，由于Western Blot是檢測在變性狀態(tài)下抗體結合的特異性，相比較而言，ELISA檢測更能反映抗體天然狀態(tài)下的特異性，因此本論文中多采用ELISA方法檢測抗體特異性。

周鶴峰等以一株克諾羅桿菌作為免疫原免疫小鼠后篩選單克隆抗體，獲得的抗體針對免疫的克諾羅桿菌特異性較好，但由于免疫原和篩選所用抗原的數量限制，沒有檢測該抗體對克諾羅桿菌屬其他細菌的覆蓋性[16]。在Igor Hoche等制備抗體的過程中，以ATCC 29544標準菌株作為抗原免疫新西蘭白兔，檢測免疫獲得的多克隆抗體與13株克諾羅桿菌（克諾羅桿菌，其中標準菌株1株，即ATCC29544，其余為分離菌株）的交叉反應性，結果發(fā)現僅對作為免疫原的ATCC 29544和另一株分離株CNCTC Eb 34/87呈現陽性反應，而對其他的克諾羅桿菌反應均為陰性[17]。

克諾羅桿菌個別菌株免疫獲得的IgGs具有血清型特異性，與其他的克諾羅桿菌菌株不能反應，表明克諾羅桿菌菌株間抗原差異較大，制備的抗血清通用性較差。要解決這個問題可以采用多種特異性抗體組合應用的雞尾酒法，雞尾酒法可以抑制檢測中的交叉反應和非特異性結合，但這一方式又增加了檢測優(yōu)化的難度。

另一方面來說，血清型特異性的抗體可以作為克諾羅桿菌血清學分型的有效工具。血清學分型是使用較為廣泛的一種分型方式，即制備一系列特異的抗血清，分別將它們與待測菌株進行凝集反應，不同菌株帶有的不同表面抗原，會與不同的血清發(fā)生凝集，根據凝集結果進行分型。常用到的表面抗原有K抗原（莢膜抗原）、O抗原（菌體抗原）及H抗原（鞭毛抗原）。大多數腸桿菌科致病菌的抗原都是關鍵的致病因子，所以血清學分型在腸桿菌科中應用廣泛。

4 結論

本研究選擇克諾羅桿菌8株標準菌株中的DSM 18702、DSM 18705、NCTC 9529、ATCC 29544菌株分別進行免疫，成功制備了針對克諾羅桿菌的多株單克隆抗體，6株單克隆抗體1F2、5C4、2H8、5A8、4H11、2H1的Ig亞類分別為IgG3、IgG2b、IgG3、IgG1、IgG3、IgG1。多種單抗采用“雞尾酒法”聯合運用能夠完全覆蓋作為陽性對照的20株克諾羅桿菌。采用抗體亞類試劑盒測定結果表明，間接ELISA法測定本研究中的6株mAb的相對親和常數均大于1.0×1010L/mol，顯示制備的單抗與克諾羅桿菌的親和力較高。將克諾羅桿菌抗體應用于膠體金試紙條的制備，試紙條檢測靈敏度為105CFU/mL，且試紙條僅對克諾羅桿菌菌株檢測為陽性，對其他細菌檢測結果均為陰性。利用單克隆抗體建立了抗原包被間接ELISA（ACP-ELISA）檢測阪崎腸桿菌的方法。為進一步研制檢測阪崎腸桿菌的膠體金免疫試紙條，建立快速的檢測方法創(chuàng)造條件。

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