李華 楊婷 岳磊 劉正玲 姜廣菊 龍潤(rùn)?quán)l(xiāng) 楊 蓉 羅芳宇 謝忠平

人類呼吸道合胞病毒(human respiratory virus，HRSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒病毒性下呼吸道感染最重要的病原體，尤見(jiàn)于嬰幼兒、老年人及免疫缺陷病人等急性呼吸道感染住院者[1]。據(jù)估計(jì)，每年在世界范圍內(nèi)有3400萬(wàn)～6500萬(wàn)的呼吸道合胞病毒感染病例和16.0萬(wàn)～19.9萬(wàn)死亡病例[2]，僅在美國(guó)，呼吸道合胞病毒導(dǎo)致每年住院大約12.5萬(wàn)例[3]。在發(fā)展中國(guó)家，RSV在嬰幼兒引起急性下呼吸道感染的病死率比較高[4]。由于該病毒的高感染率，在1歲前近70%的兒童就被首次感染，更重要的是，2歲以下嬰兒大約36%至少感染兩次[2，5]。從1956年Morris等首次發(fā)現(xiàn)該病毒至今，RSV感染引起的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)實(shí)際上比季節(jié)性流感更加嚴(yán)重，給國(guó)家和個(gè)人帶來(lái)極大的損失[6]。

雖然HRSV疫苗的研究已有50多年的歷史，但至今尚無(wú)被批準(zhǔn)使用的產(chǎn)品。因此，WHO已將呼吸道合胞病毒疫苗列為21世紀(jì)需要優(yōu)先解決的問(wèn)題之一。由于HRSV自然感染激發(fā)的機(jī)體免疫是不完全免疫，需再次或多次的HRSV感染才能完善，疫苗需要多次給藥才能達(dá)到保護(hù)嚴(yán)重下呼吸道感染的免疫水平。因此，獲得免疫原性高的病毒株，才能為后續(xù)制備RSV單克隆抗體及裂解疫苗的研究打下基礎(chǔ)。鑒于RSV感染后，T細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子在致病和抗病中有著重要的作用。對(duì)Th1/Th2細(xì)胞因子的研究，在RSV疫苗及治療藥物方面有著積極意義。至今對(duì)RSV的研究已經(jīng)涉及很多方面，但對(duì)RSV A亞型Long株免疫原性的基礎(chǔ)研究還未見(jiàn)報(bào)道，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

1.材料:(1)細(xì)胞和病毒:Hep-2細(xì)胞、KMB17細(xì)胞由本所質(zhì)量檢定室提供;RSV Long株購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。(2)主要儀器和試劑:BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫分析儀/多功能生物檢測(cè)儀為美國(guó)BIOTEK公司產(chǎn)品;BIO-RAD Chemi DocTMImaging System為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品;一抗:兔抗RSV IgG為美國(guó)IMGENEX公司產(chǎn)品;羊抗兔-HRP為abcam公司產(chǎn)品;Al(OH)3佐劑(濃度為2.0mg/ml)為本所甲肝疫苗生產(chǎn)室自制;BDTMCytometric Bead Array(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit(lot:3072948)，購(gòu)于BD公司;化學(xué)發(fā)光底物:ImmobilonTMWestern Chemiluminecent HRP Substrate(lot:1131801)，購(gòu)于Millipore公司。(3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)ICR(Institute of Cancer Research)小鼠，4周齡，雌雄各半，體重16～18g，由筆者單位靈長(zhǎng)類中心小動(dòng)物部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(滇)2010007。

2.方法:(1)實(shí)驗(yàn)性疫苗制備:取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的致密單層Hep-2細(xì)胞，培養(yǎng)并收獲病毒;初純、超濾濃縮;選擇Sepharose 4FF凝膠[8]純化，用雙抗體夾心法檢測(cè)RSV抗原含量，將RSV抗原含量高的不同收集樣品合并即為純化的HRSV樣品，合并的樣品用30kDa的超濾離心管，4000r/min，20min離心濃縮。純化HRSV加Al(OH)3或不加Al(OH)3制備成為實(shí)驗(yàn)組樣品。(2)純化產(chǎn)物的檢測(cè):不同純化收集的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳;濃縮后樣品用蛋白檢測(cè)試劑盒PierceTMBCA Protein Assay Kit檢測(cè)蛋白含量，具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū);Western blot法鑒定 SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印至PDVF膜上，以5%脫脂奶粉37℃封閉1h后，加一抗(兔抗RSV IgG多克隆抗體，濃度1∶500)4℃過(guò)夜、加二抗(羊抗兔IgG-HRP 1∶500)37℃反應(yīng)1h，化學(xué)發(fā)光底物曝光顯影。(3)免疫原性評(píng)價(jià):選取ICR小鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。2組實(shí)驗(yàn)性樣品:純化HRSV組[無(wú)Al(OH)3佐劑]、純化HRSV+Al(OH)3佐劑組[Al(OH)3使用濃度為1.0mg/ml];同時(shí)設(shè)兩個(gè)對(duì)照組:0.01mol/L PBS(pH 7.4)對(duì)照組、Al(OH)3對(duì)照組[0.01mol/L PBS(pH 7.4)配制的1.0mg/ml Al(OH)3佐劑]。免疫注射劑量:每只0.5ml，腹腔注射。免疫程序:分別于0天、28天免疫，共免疫2次，于初免后28天、加強(qiáng)后7天采血分離血清，檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)及IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF、IL-17A、IL-10 共 7 種細(xì)胞因子。(4)血清中和抗體效價(jià)檢測(cè):采用固定病毒稀釋血清的微量中和試驗(yàn)法來(lái)檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)。待測(cè)血清56℃滅活30min后，做2倍系列稀釋，每稀釋度50微升/孔，再加入2000 CCID50/ml病毒50微升/孔，混勻，37℃中和1h后，加入1×106/ml濃度的Hep-2細(xì)胞100微升/孔。置37℃、4%CO2孵箱中培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照和陰性血清對(duì)照。于第7天判定結(jié)果。以抗體效價(jià)≥1∶4為陽(yáng)性。(5)血清細(xì)胞因子的檢測(cè):用BD公司BDTMCytometric Bead Array(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠血清中的IL-2等7種細(xì)胞因子。具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。分別對(duì)組間進(jìn)行比較，對(duì)于不滿足正態(tài)分布的，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的方法進(jìn)行比較;滿足正態(tài)分布且方差齊性，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Sepharose 4FF凝膠過(guò)濾層析法純化樣品:收獲病毒液感染性效價(jià)為6.125lgCCID50/ml，抗原效價(jià)為1∶64，純化得率為44.4%。Sepharose 4FF凝膠過(guò)濾純化曲線 (圖1)。

圖1 Sepharose 4FF凝膠過(guò)濾層析法純化樣品的純化曲線

2.SDS-PAGE電泳和Western blot:經(jīng)檢測(cè)RSV抗原含量高的樣品合并，用50kDa的離心管離心濃縮，即為實(shí)驗(yàn)樣品，SDS-PAGE電泳，Bio-Rad的Quantity One軟件分析表明，純度達(dá)95%以上。Western blot檢測(cè)，可見(jiàn)為3個(gè)條帶:G蛋白90kDa、F蛋白55kDa及N蛋白46kDa(圖2)。用蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白含量為3.66mg/ml。

圖2 Sepharose 4FF凝膠過(guò)濾層析法純化樣品的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果

3.HRSV純化樣品的中和抗體:將樣品合并濃縮后，加Al(OH)3或不加Al(OH)3制備成實(shí)驗(yàn)性樣品。經(jīng)免疫程序(一免1針或二免2針)免疫ICR小鼠，每組10只，每只腹腔注射0.5ml實(shí)驗(yàn)性樣品。分別于一免后28天，加強(qiáng)免疫后7天，采血，分離血清檢測(cè)中和抗體效價(jià)(表1)，一免后，加Al(OH)3樣品組與無(wú)Al(OH)3樣品組的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為60%和50%，抗體效價(jià)分別為1∶4.49及1∶5.27，兩組間抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率及GMT值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.409)。二免后2個(gè)實(shí)驗(yàn)組抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均升高為100%，GMT分別為1∶17.15及1∶10.56，均有明顯增高，與一免后結(jié)果相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但Al(OH)3樣品組與無(wú)佐劑病毒抗原組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.220)。

表1 HRSV Long株純化樣品免疫ICR小鼠中和抗體效價(jià)

4.血清中細(xì)胞因子檢測(cè):用BD公司Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit檢測(cè)小鼠血清，小鼠血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IFN- γ、TNF、IL-17A、IL-10共7種細(xì)胞因子僅IL-6及TNF 2種細(xì)胞因子顯著上升，其余5種皆無(wú)表達(dá)(圖3、圖4)。純化HRSV+Al(OH)3組、純化 HRSV組、Al(OH)3對(duì)照組與0.01mol/L PBS對(duì)照組共4個(gè)組，一免與二免(組內(nèi))、加Al(OH)3與不加Al(OH)3樣品組(組間)之間，其細(xì)胞因子IL-6、TNF兩種細(xì)胞因子組間皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，表2)。

表2 不同免疫組IL-6與TNF兩種細(xì)胞因子含量

討 論

針對(duì)傳染病及流行病的預(yù)防，傳統(tǒng)經(jīng)典疫苗是主要的研究方向，所以應(yīng)獲得代表國(guó)內(nèi)流行的病毒株，且應(yīng)能在體外高效增殖、遺傳穩(wěn)定性高、免疫原性好的優(yōu)勢(shì)毒株，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)HRSV Long株進(jìn)行免疫原性初步探索。

將純化蛋白加入Al(OH)3或不加入Al(OH)3佐劑制備為實(shí)驗(yàn)樣品組，免疫ICR小鼠，病毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明，第1次免疫后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)60%及50%，加強(qiáng)免疫后，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率皆達(dá)100%，抗體幾何平均效價(jià)(GMT)分別為1∶17.15和1∶10.56，平均增長(zhǎng)3.8倍和2.0倍，但一免及二免后中和抗體鋁佐劑組與無(wú)佐劑組GMT差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抗體水平顯著升高，但是效價(jià)較低，這與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的RSV A2株的免疫結(jié)果相符。實(shí)驗(yàn)雖然不是同一病毒株，但都屬于A亞型，究其原因:是否由于RSV病毒是有包膜的病毒，經(jīng)過(guò)病毒的初純、超濾濃縮、凝膠純化及再濃縮(超濾離心)一系列處理對(duì)病毒的影響所導(dǎo)致。

圖3 純化HRSV Long株免疫小鼠不同組別IL-6含量

圖4 純化RSV Long株免疫小鼠不同組別TNF含量

另一個(gè)原因是否由于該毒株的生物學(xué)特性及基因編碼與其他病毒的具體差異所致，在獲得RSV Long株后，對(duì)病毒株擴(kuò)大培養(yǎng)至第5代，并進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增病毒的F基因、G基因及N基因，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)(比對(duì)株GenBank登錄號(hào):AY911262.1):RSV-N蛋白核苷酸同源性為97.48%，RSV-F蛋白為94.01%，RSV-G蛋白為99.78%。該毒株的F蛋白同源性較G蛋白低，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道不一致，但都大于90.00%，同源性的差異是否與血清效價(jià)有直接關(guān)系，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

20世紀(jì)60年代研制的甲醛滅活疫苗(F1-RSV)的研究發(fā)現(xiàn)，HRSV滅活疫苗具有疾病加強(qiáng)作用，可能原因是破壞了小鼠輔助性T細(xì)胞Th1和Th2亞群動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[9]。本次研究小鼠血清的細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅有IL-6及TNF2種細(xì)胞因子升高，而IFN-γ、IL-4、IL-2皆未升高。實(shí)驗(yàn)中 Al(OH)3佐劑的使用，主要于注射位點(diǎn)的沉積，誘導(dǎo)動(dòng)物模型的Th2型免疫應(yīng)答，但結(jié)果顯示佐劑的使用并未顯著增加HRSV的免疫效果，所產(chǎn)生的抗體與無(wú)佐劑組無(wú)顯著差異[10]。所以該RSV Long株所誘導(dǎo)的免疫是平衡的，未見(jiàn)明顯的疾病加強(qiáng)指標(biāo)。

另外，IL-6及TNF 2種細(xì)胞因子的升高，是否可以從以下得到解釋:Levitz等[11]報(bào)道無(wú)論是在體內(nèi)和體外，IL-6促炎細(xì)胞因子是宿主對(duì)呼吸道合胞病毒感染的反應(yīng)產(chǎn)物。Pribul等[12]發(fā)現(xiàn)肺部早期趨化因子分泌的峰值是由巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，肺泡巨噬細(xì)胞受激活導(dǎo)致大量促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生包括MIP1α、TNF-α、IL-6、IL-8。實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的IL-6及TNF2種細(xì)胞因子升高，是否由于肺泡巨噬細(xì)胞激活所致尚待進(jìn)一步證實(shí)。Choi等[13]報(bào)道腫瘤壞死因子(TNF)與兒童呼吸道感染RSV引起嗜酸性粒細(xì)胞炎癥有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，人外周血多形核顆粒細(xì)胞(PMN)感染RSV后可分泌IL-6且IL-6的含量與接觸病毒的數(shù)量有密切關(guān)系，Grell等報(bào)道的IL-6的產(chǎn)生呈現(xiàn)年齡依賴性，即年齡越小的動(dòng)物越容易產(chǎn)生。

綜上所述，如何在保持免疫原性的基礎(chǔ)上，使RSV病毒樣品能誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2反應(yīng)，增加疫苗的安全性，是RSV疫苗研究的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)初步探討了RSV Long株抗原的免疫原性，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，本研究所制備的HRSV能誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的體液免疫及細(xì)胞免疫，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究HRSV疫苗提供了實(shí)驗(yàn)資料。

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