汪長(zhǎng)健 楊關(guān)根 丁 菁 廖秀軍

研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog 信號(hào)通路異常激活可導(dǎo)致人類多種腫瘤的發(fā)生，包括基底細(xì)胞癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等［1］。通路的激活可導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因(Gli1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP - 6)、細(xì)胞周期蛋白D2(cyclin D2)骨橋蛋白(OPN)等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞向惡性生物學(xué)行為轉(zhuǎn)化，并最終發(fā)生腫瘤［2］。Hedgehog 信號(hào)通路與結(jié)直腸癌的關(guān)系目前尚無(wú)定論，在人類一些大腸癌細(xì)胞系如CaCo2、HT29 以及SW480 中，可以檢測(cè)到SHH、PTCH、SMO、SUFU 及Gli 的表達(dá)，而在Colo320 中未檢測(cè)到Gli 等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)［3，4］。本實(shí)驗(yàn)以結(jié)直腸癌標(biāo)本為研究對(duì)象，觀察Hedgehog 信號(hào)通路中Gli1 及其下游靶基因OPN 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，分析二者之間的相關(guān)性，進(jìn)一步探討它們的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理因素之間的關(guān)系。

材料與方法

1.材料:收集2009 年5 月～2010 年12 月杭州市第三人民醫(yī)院肛腸科行結(jié)直腸癌根治手術(shù)并具有完整臨床資料的病理標(biāo)本76 例，所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。其中男性為40 例，女性36 例;患者年齡39 ～81 歲，中位年齡54.5 歲。Dukes 分期:A 期11 例;B 期20 例，C 期31 例、D 期14 例，組織學(xué)分型:高分化13 例、中21 分化、低分化36 例、未分化6例。結(jié)腸癌33，直腸癌43 例。取距癌組織10cm 以上無(wú)浸潤(rùn)的正常大腸組織為對(duì)照，所有對(duì)照標(biāo)本經(jīng)HE 染色鏡下未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞。

2.試劑與方法:一抗兔抗人Gli1 抗體和鼠抗人OPN 單克隆抗體試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。二抗購(gòu)于杭州隆基生物技術(shù)有限公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山生物科技公司。所有標(biāo)本均以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，每例以5μm 厚度連續(xù)切片，用于免疫組化染色。應(yīng)用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(SP)法，操作步驟按試劑盒提示進(jìn)行，切片經(jīng)處理后進(jìn)行HE 染色和免疫組化染色。Gli1 的工作濃度為1∶150，OPN 的工作濃度為1∶200。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的Gli1 和OPN 陽(yáng)性的乳腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照。

3.結(jié)果判定:由兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，對(duì)切片染色結(jié)果進(jìn)行判定。Gli1 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)于細(xì)胞核，為棕黃色顆粒狀。OPN 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)于細(xì)胞膜，為黃色或棕黃色顆粒狀。每張切片隨機(jī)選取10 個(gè)高倍鏡視野(×400)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及顯色深淺進(jìn)行分類處理。其中染色強(qiáng)度:0.無(wú)染色;1.淡黃色;2.棕黃色;3.棕褐色。后按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比記分:＜5%為0 分，5% ～25%為1 分，25% ～50%為2 分，50% ～75%為3 分，＞75%為4 分;兩項(xiàng)分值相加為每張切片組織染色積分，＞3 分記為陽(yáng)性，≤3 分記為陰性。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，Gli1 和OPN 表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析方法，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Gli1 蛋白在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達(dá):Gli1 蛋白在76 例結(jié)直腸癌中有33 例呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為43.4%。在23 例正常組織中3 例陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為13.0%，Gli1 在癌組織中表達(dá)高于正常組織，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.OPN 蛋白在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達(dá):OPN 蛋白在76 例結(jié)直腸癌中有39 例呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為51.3%。在23 例正常組織中4 例陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為17.4%，OPN 在癌組織中表達(dá)高于正常組織，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

3.Gli1 和OPN 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理特征的關(guān)系:Gli1 和OPN 的表達(dá)均與性別、年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P ＞0.05)，與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、Dukes 分期有關(guān)(P ＜0.05)，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期較晚的患者，Gli1 和OPN 的表達(dá)均顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高。OPN 的表達(dá)與腫瘤的分化程度無(wú)關(guān)，而Gli1則顯示出較強(qiáng)的相關(guān)性(P ＜0.01)，組織學(xué)分化越差，Gli1 表達(dá)越高(表1)。

表1 Gli1 和OPN 蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理之間的關(guān)系

4.Gli1 和OPN 之間表達(dá)的相關(guān)性:采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析:Gli1 與OPN 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.312，P ＜0.01，表2)。

討 論

Hedgehog 信號(hào)通路是生物胚胎發(fā)育過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，它高度保守，一旦果蠅的該通路基因發(fā)生突變，其幼蟲(chóng)形似刺猬(Hedgehog)，因此得名。Gli1 是Hedgehog 信號(hào)通路中激發(fā)下游轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵分子，當(dāng)細(xì)胞膜外分泌型配體(Shh/Ihh/Dhh)與跨膜受體蛋白Ptch 結(jié)合，促使其解除對(duì)另一跨膜蛋白Smo 的抑制作用，從而導(dǎo)致Gli1 進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄［5］。人類的多種先天性疾病如氣管食管瘺、肛門(mén)閉鎖和腸道畸形等都與Hedgehog 信號(hào)通路中某些基因的突變有關(guān)。研究證明Hedgehog的異?；罨c腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，通過(guò)抑制該通路的激活有可能成為腫瘤治療的新途徑。關(guān)于Gli1 在結(jié)直腸癌中的作用存在爭(zhēng)議，有研究證實(shí)Hedgehog 信號(hào)通路中的效應(yīng)分子Shh、SMO、Gli1 在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá);而在伴有Wnt 信號(hào)通路活化的結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中，Gli1 則處于沉默狀態(tài)，且通過(guò)轉(zhuǎn)染Gli1 基因可抑制腸癌細(xì)胞的增殖［6，7］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gli1 在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其陽(yáng)性率為43.4%，而正常結(jié)腸組織中為13.0%，說(shuō)明Gli1 的高表達(dá)參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。進(jìn)一步分析提示Gli1 的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分型、病理分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)，組織學(xué)分化差、病理分期晚和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Gli1 陽(yáng)性表達(dá)率高。據(jù)此可認(rèn)為Hedgehog 信號(hào)通路在結(jié)直腸癌中是被激活的，效應(yīng)分子Gli1 促進(jìn)了正常結(jié)直腸組織向腫瘤的演變。

表2 Gli1 和OPN 之間表達(dá)的相關(guān)性

OPN 是一種分泌型磷酸化糖蛋白，分子質(zhì)量約(41 ～72)kDa，富含與細(xì)胞黏附功能有關(guān)的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，廣泛存在于骨組織、脈管系統(tǒng)、腎臟、炎癥細(xì)胞和分泌型上皮細(xì)胞，同時(shí)也在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，參與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，并與預(yù)后密切相關(guān)。已有研究證實(shí)OPNmRNA 在人類結(jié)直腸癌細(xì)胞株和組織中表達(dá)上調(diào)，且OPNmRNA 的表達(dá)狀態(tài)為結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素［8］。通過(guò)RNA 干擾可抑制大腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、黏附和趨化能力，并起到放療增敏作用［9］。Das 通過(guò)檢測(cè)基底細(xì)胞癌組織中Gli1 和OPN 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于局限性基底細(xì)胞癌，伴有轉(zhuǎn)移灶的患者組織中二者表達(dá)明顯升高，而且當(dāng)Hedgehog 信號(hào)通路活化時(shí)，OPN 的表達(dá)也呈現(xiàn)上調(diào)狀態(tài);當(dāng)該信號(hào)通路被特異性抑制劑Cyclopamine 阻斷時(shí)，OPN 的表達(dá)隨即下調(diào)。由此推測(cè)OPN 為Hedeghog 信號(hào)通路下游的效應(yīng)蛋白，由Gli1 介導(dǎo)的OPN 上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［10］。本組結(jié)直腸癌OPN 陽(yáng)性表達(dá)率為51.3%，結(jié)直腸癌組OPN 表達(dá)的陽(yáng)性率較結(jié)正常結(jié)直腸組織高。OPN 表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)分化無(wú)關(guān)，但在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、病理分期晚者表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移、病理分期早者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示OPN在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

雙變量相關(guān)性分析表明，OPN 和Gli1 二者在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)正相關(guān)，證實(shí)了Gli1 的上調(diào)可促進(jìn)其下游效應(yīng)蛋白OPN 的表達(dá)，二者共同影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性增殖和浸潤(rùn)能力。至于Gli1 通過(guò)何種途徑調(diào)控OPN 尚待進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

本研究證實(shí)了Hedgehog 信號(hào)通路在大腸癌中是激活的，Gli1 和OPN 都呈高表達(dá)，參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生以及浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程，二者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)具有協(xié)同作用。因此檢測(cè)Gli1 和OPN 可能有助于判斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為，為患者預(yù)后提供參考，并對(duì)結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)和靶向治療帶來(lái)新的思路。

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